兩種提取小鼠血清來源外泌體方法的比較

孫有良 王宇童

[摘要] 目的 比較超速離心法與純化試劑盒提取法提取血清外泌體的有效性與實用性，為后續外泌體相關研究提供借鑒。 方法 將12只6～8周C57BL/6雄性小鼠按照隨機數字表法分為兩組，每組6只，即超速離心法提取組及純化試劑盒提取組。分別用兩種方法分離小鼠血清中的外泌體。使用納米粒度及zeta電位儀（Nano ZS90）檢測兩組外泌體的粒徑大小及分布;使用透射電子顯微鏡觀察兩種方法提取外泌體的形態結構;采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測外泌體標志蛋白的表達水平;對兩種方法所提取外泌體中的核糖核酸（RNA）分離鑒定，比較兩種方法提取外泌體中RNA的異同。 結果 兩組所得的外泌體直徑為30～150 nm，形態均為脂質雙分子層囊泡樣，Western blot法檢測結果顯示兩組外泌體均表達標志蛋白cluster of differentiation 63和tumor susceptibility gene，差異無統計學意義（P > 0.05）;與純化試劑盒提取組比較，超速離心法提取組的外泌體濃度更高，差異有統計學意義（P < 0.05），且超速離心法提取組中外泌體所含RNA以microRNA為主，而純化試劑盒提取組的外泌體中所含RNA主要為piRNA。 結論 超速離心法與純化試劑盒提取法均能有效提取外泌體，但所得到的外泌體包含不同RNA成分，為外泌體的研究提供更有效的選擇方法。

[關鍵詞] 小鼠血清;外泌體;超速離心法;純化試劑盒提取法

[中圖分類號] Q26? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（a）-0004-04

[Abstract] Objective To compare the effectiveness and practicability of extraction of serum exosomes by ultracentrifugation and purification kit， and to provide references for subsequent exosome studies. Methods Twelve C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were divided into two groups by random table method， with 6 mice in each group， that was the ultracentrifugation extraction group and the purification kit extraction group. Exosomes in mouse serum were isolated by two methods. The particle size and distribution of exosomes in the two groups were detected by Nano particle size and zeta potentiometer（Nano ZS90）. The morphological structures of exosomes were extracted by transmission electron microscopy. Western blot was used to detect the expression level of exosome marker proteins. Ribonucleic acid （RNA） was isolated and identified from exosomes extracted by the two methods. Results The outside diameter of the proceeds of two groups was 30-150 nm， and morphology was lipid bilayer vesicle. Western blot results showed that the exosomes in both groups expressed the marker protein cluster of differentiation 63 and tumor susceptibility gene， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the purification kit extraction group， the ultracentrifugation extraction group had a higher exosomes concentration， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Moreover， the RNA in the exosomes in the ultracentrifugation extraction group was mainly microRNA， while the RNA in the exosomes in the purification kit extraction group was mainly piRNA. Conclusion The ultracentrifugation and purification kit extraction method can both effectively extract exosomes， but the exosomes obtain different RNA components， which provides a more effective selection method for the study of exosomes.

[Key words] Mouse sera; Exosomes; Ultracentrifugation; Purification kit extraction method

外泌體是一種由多種細胞分泌的脂質雙分子層囊泡結構，直徑介于30～150 nm之間，可存在于血清、唾液、尿液等多種體液中[1-3]。外泌體是細胞間的一種新型通訊方式，可以影響機體的多種生理病理過程，如機體免疫應答、細胞分化、腫瘤侵襲等方面，因而近年外泌體的相關研究呈現“井噴式”增加[4-7]。研究發現，外泌體內容物極其豐富，包含核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、蛋白和脂類[8-9]。其中，一些表達于外泌體的特異性蛋白標志物如cluster of differentiation 63（CD63）、tumor susceptibility gene（TSG101）和hot shock protein 70（HSP70）等可以用于外泌體的鑒定[10-11]。對外泌體的基礎研究和臨床應用的開發都需要快速有效的分離方法，目前主要包括超速離心法、外泌體純化試劑盒提取法以及聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）沉淀法[12-14]，但均未形成標準化體系，更鮮有研究比較這些方法的效率和實用性。本文旨在比較通過超速離心法及純化試劑盒提取法從小鼠血清樣品中提取外泌體的實驗方法的實用性及有效性，并充分考慮了其在臨床實驗室和醫療點設置中的優缺點，為后續外泌體的研究和應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周C57BL/6雄性小鼠由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[生產許可證號：SCXK（京）2019-0008，使用合格證號：SYXK（京）2018-0003]。飼養于首都醫科大學實驗動物中心，室溫18～23℃，相對濕度45%～55%。按照隨機數字表法將其分為兩組，每組6只，即超速離心法提取組及純化試劑盒提取組。

1.2 儀器與材料

CD63抗體（批號：25682-1-AP）、TSG101抗體（貨號：ab125011）購于美國Abcam公司;MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS外泌體純化試劑盒（批號：293-77601）購于北京經科宏達生物技術有限公司;QIAGEN抽提試劑盒（批號：217184）、PKH67綠色熒光細胞標記試劑盒（批號：PKH67GL-1KT）購于泰科蘭博（北京）生物有限公司;納米粒度及zeta電位儀（Nano ZS90）購于英國馬爾文公司;LE-80 Ultracentrifuge 低溫超速離心機（ITEM：24830）購于美國Beckman公司，轉子半徑11.1 cm;透射電鏡（Tecnai G2 spititi）購于美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 超速離心法提取外泌體? 以尾靜脈取血法分別從兩組小鼠體內收集2 mL血清樣品，加入13 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），300 g，4℃，離心10 min（離心機半徑11.1 cm）。取上清，12 000 g，4℃，離心40 min。取上清，通過0.22 μm濾膜過濾。超速離心120 000 g，4℃，離心1.5 h，棄上清。沉淀用15 mL PBS溶液吹打洗滌，100 000 g，4℃，離心1 h，沉淀為外泌體。

1.3.2 純化試劑盒提取外泌體? 首先用固定緩沖液清洗60 μL 磁珠，掌式離心機離心1 min，去除上清，分別添加500 μL固定緩沖液及10 μL Biotin-labeled Exosome Capture。在2～10℃條件孵育10 min，離心去除緩沖液后用固定緩沖液清洗兩次。向樣品中添加binding enhancer及磁珠，在2～10℃條件下孵育3 h，去除溶液。預先準備洗滌緩沖液，添加binding enhancer，清洗磁珠，重復3次。添加50 μL elution buffer到清洗過的外泌體結合磁珠的反應管中，渦旋，室溫靜置10 min。離心后收集得到含外泌體的溶液。

1.3.3 外泌體粒徑分析? 吸取10 μL上述提取的外泌體樣本，用PBS稀釋為1 mL，用納米粒度及ZETA電位儀進行測試。

1.3.4 透射電鏡成像? 將外泌體樣本離心，吸取15 μL外泌體樣本于銅網上靜置1 min。使用濾紙將銅網上的外泌體樣本吸干，然后吸取15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙將銅網上的外泌體樣本吸干，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，觀察拍照。

1.3.5 蛋白印跡實驗? 向上述提取的外泌體懸液中添加上樣緩沖液，95℃加熱10 min變性。每個上樣孔添加20 μg蛋白樣品在10%丙烯酰胺凝膠中電泳2 h，電泳后使用電轉儀2 h把蛋白質轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，在搖床孵育1 h，在4 ℃條件下孵育CD63、TSG101 以及HSP70一抗16 h，再隔日加入相應二抗室溫孵育1 h，在蛋白成像系統中曝光成像。

1.3.6 外泌體所包含RNA的濃度檢測? 將小鼠血清樣本溶于QIAzol Lysis Reagent中，加入氯仿，冰上靜置10 min，12 000 g，4℃，離心15 min。提取上層水相，加入乙醇。樣品再加入RNeasy MinElute離心柱，總RNA被結合到膜上。然后使用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control進行標準化。

1.3.7 免疫熒光實驗? 將PKH67和稀釋液按1∶50的比例配20 μL，PBS稀釋成200 μL，PKH67和外泌體混勻室溫孵育10 min。加細胞培養基終止標記反應。12 000 g，4℃，離心30 min，棄上清，加PBS重懸。12 000 g，4℃，離心30 min，棄上清加細胞培養基重懸。共聚焦小皿棄掉細胞培養基加入含有外泌體的細胞培養基。24 h后加入4%多聚甲醛固定30 min，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）標記細胞核，30 min后進行檢測。

1.3.8 外泌體包含RNA的分析? 將超速離心法提取組與外泌體純化試劑盒提取組的外泌體行轉錄組二代測序，對兩組中外泌體包含的RNA進行初步分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理，實驗均重復3次，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體粒徑分析

粒徑檢測結果顯示，兩組方法所提取的外泌體粒徑大小較集中，超速離心法提取組外泌體粒徑[（69.24±1.12）nm]與純化試劑盒提取組外泌體粒徑[（74.34±0.98）nm]比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 透射電鏡結果

透射電鏡結果顯示，兩組所提取的外泌體在鏡下均呈一側凹陷的半球形雙層膜囊泡，囊泡直徑在30～150 nm之間。見圖2。

2.3 外泌體標志蛋白的檢測

Western blot結果顯示，兩種方法所提取組的外泌體均能檢測到CD63和TSG101等外泌體標志蛋白，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 外泌體所含RNA濃度檢測分析

RNA濃度檢測結果顯示，超速離心法提取組的RNA濃度低于純化試劑盒提取組提取的RNA濃度，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖4A～B（封三）。標記綠色熒光的PKH67是外泌體表面的標志蛋白，免疫熒光結果顯示，超速離心法提取組外泌體數量低于純化試劑盒提取組提取的外泌體數量，見圖4C～D（封三）。與純化試劑盒提取組比較，超速離心法提取組外泌體RNA濃度較低（P < 0.05），總量較低（P < 0.05），microRNA含量較高（P < 0.05）。見表1。

2.5 外泌體所含RNA分析

測序結果顯示，超速離心法提取組的外泌體所含RNA大小主要集中在20～23 nt，通過與數據庫比較，進一步分析RNA種類主要為microRNA。而純化試劑盒提取組的外泌體中所含RNA的大小集中在28～33 nt，RNA的種類主要為piRNA。見圖5（封三）。

3 討論

20世紀80年代外泌體發現初期，研究者認為其僅僅用于攜帶細胞代謝被排出體外[15]。隨著研究的深入，人們對外泌體的功能有了進一步的認識，研究發現其在介導細胞通訊以及疾病診斷的過程中發揮著獨到的作用[16-18]。與傳統的診斷手段比較，外泌體作為疾病診斷的生物標志物對患者的創傷更小，診斷樣本更容易獲取。外泌體也可以作為靶向藥物的載體發揮作用，通過囊泡運輸的方式將藥物運輸到靶定的位置[19-20]。

目前國內外對外泌體的提取方法各異并且每種方法都存在優缺點，如何從各種方法中挑選能夠滿足自身實驗要求的方法是各位研究者共同關心的問題。本研究發現，超速離心法、外泌體純化試劑盒提取法均能夠在小鼠血清中成功提取外泌體。本研究發現超速離心法提取的外泌體包含的小RNA種類主要為microRNA，而純化試劑盒提取的外泌體包含的小RNA種類主要為piRNA，而造成這一差異的原因仍有待于進一步研究。這一結果對今后需要檢測外泌體中RNA成分的研究者具有一定的借鑒意義。綜上所述，兩種方法都能夠從小鼠血清中成功提取外泌體，但外泌體包含的成分明顯不同，故后續更關注外泌體中microRNA的功能則應選擇超速離心法分離，而后續研究更關注piRNA則應主要采用純化試劑盒提取外泌體。當然，在進行外泌體研究時也需考慮實驗室的具體條件，超速離心法對設備要求高，耗費時間長，但所得外泌體純度較高，適用于對外泌體純度要求更加精確的相關機制研究。純化試劑盒提取法的操作步驟簡單，實驗耗時短，可同時處理較多的樣品，適用于對外泌體純度要求不高但容量較大的樣品。

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（收稿日期：2019-11-28? 本文編輯：劉永巧）