山藥不同炮制品丸劑物性參數及尿囊素體外溶出研究*

陳天朝，李 沁，姚 超，耿夢麗，常倩倩，于蘭蘭，馬彥江

(1.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450000； 3.河南醫藥技師學院制劑工程系，河南 開封 457000；4.河南省直第三人民醫院藥學部，河南 鄭州 450000)

中藥炮制是根據中醫藥理論，依照辨證論治用藥的需要、藥物自身性質和調劑、制劑的不同要求所采取的一項傳統制藥技術，是中藥內部大分子和小分子受熱發生變化，分子間化學鍵發生斷裂后重新結合的過程[1]。中藥飲片經過炮制后可加工制成丸劑，具有便于攜帶、服用方便、保質期長等優點。丸劑的制作，從飲片到打粉再到制丸，存在著物性的變化。物性即物質固有的物理和化學屬性，對所選取中藥飲片及炮制品，一般從“形”“色”“氣”“味”“質”進行評價，而這些評價指標可以通過物料相關物性的相對密度、氧化值、吸水率、吸水膨脹度、pH值等測定進行數字化度量，再通過對炮制過程中小分子成分含量的變化，優選出符合中醫藥整體觀的、過程可控的中藥炮制方法。山藥來自薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖，載于《神農本草經》，位列上品，具有補脾胃、益肺腎的作用[2]。山藥的炮制有麩制和清炒制，有關麩炒的研究比較多。本實驗側重于清炒炮制中的炒黃、炒焦研究[3-4]。清炒制的山藥具有降血糖、調節免疫和抗衰老的作用[5]。山藥中所含的尿囊素是小分子化合物，是山藥的有效成分，可以促進上皮組織修復，生肌，被用于胃及十二指腸潰瘍的治療。本實驗著重研究炮制后山藥丸劑中尿囊素與丸劑物性間的相關性，通過對山藥不同炮制品丸劑物性參數(吸水率、膨脹度、氧化值、pH值)與有效成分間的相關性研究并建立回歸線性模型。

1 藥品、試劑與儀器

山藥(批號1710201)、山藥炒黃(批號1710201)、山藥炒焦(批號1710201)，均為河南中一醫藥經營有限公司產品，經河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部王宏賢副主任藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖。尿囊素，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究所提供，批號111501-200202；甲醇(批號20170903)、無水乙醇(批號20170529)、乙醚(批號20170415)，均為分析純，煙臺市雙雙化工有限公司產品；甲醇，色譜純，Sigma試劑公司產品。元素型18120純水裝置，上海摩勒科學儀器有限公司產品；UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司產品；BSA224S-CW型電子天平，德國賽多利斯公司產品；KQ5200B型機械超聲波清洗儀器，上海合金超聲設備有限公司產品。

2 方法與結果

2.1 山藥丸劑制備

表1 山藥丸劑均勻設計表 n=3

表2 山藥丸劑最佳泛制工藝

表3 山藥丸劑質量檢測 n=3

2.2 山藥丸劑物性參數的測定

按照參考文獻[8]方法。

2.2.1 吸水率測定

將漏斗放置于恒溫恒濕、盛有純化水的干燥器內。將濾紙折疊后放入漏斗內飽和3 min，取出后放置于干燥濾紙上并放置配重。靜置30 s后，精密稱取吸水飽和濾紙質量，再放回內漏斗內。精密稱取1.00 g不同炮制品丸劑置于濾紙中(水完全浸沒不同炮制品丸劑，但水面低于濾紙上層邊緣)。靜置1 h后，過濾3 min，同法處理帶有丸劑的濾紙。每種不同炮制品丸劑平行測定3次，取平均值，計算吸水率。

2.2.2 膨脹度的測定

按照2015版《中國藥典》四部通則2101膨脹度的測定方法[9]。

2.2.3 相對密度的測定

稱取不同炮制品丸劑1.00 g并記錄其質量m；取25 mL膨脹度測定管，量取一定體積輕質液態石蠟并記錄其體積V1；將稱量質量后的中藥飲片投入膨脹度測定管中，使不同炮制品丸劑完全浸沒于液態石蠟液面以下，靜置至無氣泡產生。記錄投入不同炮制品丸劑后輕質液態石蠟體積V2。每種炮制品丸劑平行測定3次，取平均值作為其相對密度[10]。計算不同炮制品丸劑相對密度d。

2.2.4 pH值的測定

取純水100 mL，準確稱取不同炮制品丸劑1.00 g，加入100 mL純化水中，室溫下浸泡1 h，過濾，取濾液，測pH值。每種炮制品丸劑平行測定3次，取平均值。

2.2.5 氧化值的測定

稱取山藥炮制品丸劑7.50 g，置于裝有300 mL純水的圓底燒瓶中，混合均勻后接入蒸餾裝置，精確收集前50 mL餾分。用移液管準確移取20 mL餾分于滴定瓶內，加入硫酸水溶液5 mL和0.002 mol/L KMnO4溶液10 mL，振蕩均勻后室溫下反應30 min；然后加入質量分數100 g/L的KI水溶液5 mL，滴加Na2S2O3標準溶液，當溶液由黃棕色或深黃色變成淺黃色時，加1 mL淀粉溶液為指示劑，繼續用0.02 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定至無色。記錄消耗Na2S2O3標準溶液體積為V3(mL)[11]。另以丸劑等質量水代替樣品重復上述操作進行空白試驗，記錄消耗Na2S2O3標準溶液體積為V4(mL)。氧化值OX公式：

式中：C為Na2S2O3標準溶液濃度(mol/L)，m為丸劑質量。

2.2.6 物性參數測定結果

測得不同炮制品山藥丸劑物性參數(吸水率、吸水膨脹度、相對密度、pH值、過氧化值)3次平均值，見表4。經過不同程度的炮制，相對密度、pH值、過氧化值增大。

表4 山藥丸劑物性參數均值 n=3

2.3 尿囊素含量的測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq( 4.6 mm×250 mm，5 μm ),流動相為甲醇-水(1∶99)，流速 0.5 mL /min，進樣量10 μL，檢測波長224 nm，柱溫30 ℃[8]。尿囊素色譜圖如圖1。

A.尿囊素對照品；B.山藥生品丸劑；C.山藥炒黃丸劑；D. 山藥炒焦丸劑；1. 尿囊素

2.3.2 供試品溶液制備

取上述丸劑適量，粉碎，精密稱量1.00g，加體積分數為200 mL/L的乙醇20 mL，超聲(200 W，40 KHz)提取60 min，濾過，加體積分數為200 mL/L的乙醇定容于25 mL容量瓶中，震蕩10 min，3 000 r/min 離心20 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得[8]。

2.3.3 對照品溶液制備

精密稱取尿囊素對照品10.00 mg于25 mL量瓶中，加200 ml/L乙醇溶解定容至刻度，即得。

2.3.4 線性關系考察

精密吸取0.1，0.5，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL對照品溶液于10 mL量瓶，加200 mL/L的乙醇定容。依次進樣10 μL，按2.3.1項下方法進樣測定，記錄色譜峰面積，以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線Y= 9.874X+0.258，r2=0.998。結果表明，尿囊素在4～400 mg/L范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗

取山藥丸劑粉末，制備供試品溶液，按照2.3.1項下的方法進行精密度考察，結果峰面積平均值為9.08，RSD值為0.94%。結果表明，此方法精密度良好。

2.3.6 穩定性實驗

取山藥丸劑粉末，按照2.3.1項下方法，在時間點0，2，4，8，12，24 h進行穩定性考察，結果平均峰面積為9.09， RSD值為0.98%。結果表明，此方法穩定性良好。

2.3.7 重復性實驗

取山藥丸劑20.00 g，平行取6份，精密稱定，按2.3.1項下方法進行重復性實驗，結果得到的RSD值為1.41%。結果表明，此方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率實驗

取已知尿囊素含量的山藥生品丸劑細粉0.5 g，精密稱定，平行操作6份，分別加入200 mg/L尿囊素對照品溶液5 mL，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，計算得出尿囊素的平均加樣回收率、RSD值，見表5。結果表明，此方法準確性良好。

表5 尿囊素回收率考察 n=6

2.3.9 尿囊素含量測定結果

取丸劑粉末1.00 g，平行3份，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。通過與尿囊素對照品對比，山藥炒焦后丸劑中尿囊素所對應的峰消失，且山藥炒黃、炒焦后共同出現了3號峰，炒焦后出現4號峰，清炒制后的山藥丸劑出現了新峰。山藥不同炮制品丸劑尿囊素含量測定結果見表6。

表6 丸劑中尿囊素含量測定結果 n=3

2.4 山藥丸劑體外溶出含量測定及溶出模型構建

2.4.1 溶出液含量測定

選擇槳法進行丸劑體外溶出實驗[12]，以脫氣后的純水900 mL作為溶出介質，設定溶出儀轉速為100 r/min，調節溫度為(37±0.5) ℃。在投藥前先將溶出儀保溫30 min，精密稱量丸劑20.00 g投入溶出杯，投藥時打開溶出儀轉槳并開始計時；在投藥后2，5，10，20，30，60，120，240，480 min取樣25 mL，并補充同體積、同溫度溶出介質。山藥丸劑各時間點累積溶出百分率結果見表7。溶出液處理后經0.45 μm 濾頭過濾后，置于HPLC中進樣，進行含量測定。通過溶出百分率做出尿囊素溶出曲線圖，見圖2。結果表明，清炒炮制對山藥丸劑尿囊素的溶出速率有減緩作用。

表7 山藥丸劑尿囊素各時間點累積溶出百分率

圖2 山藥丸劑尿囊素溶出曲線圖

2.4.2 山藥丸劑尿囊素溶出模型擬合方程

利用威布爾分布(WeibuLL)建立模型F=1-exp(-(t-α)^γ/β)，F表示尿囊素溶出率百分比，γ為形狀參數即斜率。用Excel分析ln(ln(1/(1-F(t))))與ln(t-α)得到一元線性回歸方程[13]，通過對比R2得出威布爾模型優于對數模型，故以威布爾模型作為山藥丸劑尿囊素溶出規律模型，結果見表8。

表8 山藥丸劑尿囊素溶出模型擬合方程

注：e為自然對數的底數，t代表溶出時間。

2.5 相關性分析

2.5.1 清炒法對丸劑物性參數相關性檢驗

運用SPSS 24.0對山藥丸劑指標成分與物性參數進行相關性分析[14]，結果見表9。從表9中可知，山藥丸劑尿囊素與相對密度、pH值及氧化值間存在極強相關性。

表9 山藥丸劑尿囊素與物性參數之間相關性 n=9

注：*P<0.01。

2.5.2 尿囊素與氧化值及相對密度線性關系分析

運用SPSS 24.0軟件，采用步進法進行線性回歸分析[15]，可知尿囊素與氧化值及相對密度呈線性回歸關系(P<0.01)，與pH值線性關系不明顯。線性回歸方程為Y=24.297 86+0.050 111X1-27.312 2X2(X1為氧化值，X2為相對密度)。因此，可以通過對氧化值與相對密度的測定來間接反映不同炮制品山藥丸劑尿囊素的含量，山藥丸劑尿囊素與氧化值及相對密度相關性分析見表10。

2.5.3 清炒制法與尿囊素含量間多重性分析

清炒制法與尿囊素含量間多重性分析得出，山藥炒黃、炒焦丸劑與山藥生品丸劑顯著性相關，置信水平95%，見表11。

表10 山藥丸劑尿囊素與氧化值及相對密度間的線性相關性分析

注：因變量為尿囊素。

表11 尿囊素含量與清炒法的多重性分析

注：因變量為尿囊素，*P<0.05。

3 討 論

本實驗通過對3種山藥炮制品丸劑物性參數的測定發現：隨著炮制程度的加大，丸劑的相對密度、pH值、氧化值增大，吸水率先減小后增大，吸水膨脹度先增大后減小。中藥飲片在炮制過程中由于溫度的持續上升快速地氧化。美拉德反應證明：中藥飲片在高溫下，其成分中的氨基和羰基發生反應，產生褐色成分同時伴隨pH值和過氧化值的變化；隨著炮制溫度的升高、炮制時間的增加，藥材的質地變硬，導致吸水率減小；隨著炒制程度加深，藥材粉性增加，從而吸水率增加。另外，炮制也會對山藥飲片中的小分子成分產生影響。尿囊素作為山藥丸劑的指標性成分，隨著炮制程度加深其含量減少，HPLC色譜中出現新的色譜峰，提示可能在此過程中產生了新的化學成分。本實驗可以看出，炮制后的山藥丸劑物性參數與有效成分之間具有一定的相關性。從中醫藥的整體觀來看，物性和炮制工藝間有著一定的傳遞性，炮制會引起中藥丸劑物性參數及有效成分含量的變化，可以兩者之間的相關性為基礎，更加全面科學地對中藥炮制理論進行研究。

本次實驗得出山藥丸劑中尿囊素的溶出可以構建一定的線性回歸模型，結合尿囊素與物性參數間的相關性，可以為中藥飲片制丸提供一定的數據參數指導， 可以克服一些傳統經驗鑒別的弊端，比如通過色澤、外形等對中藥飲片進行鑒別。中藥炮制需要現代化、智能化。探討山藥不同炮制品丸劑的有效成分和物性參數，以及物性參數之間存在的關聯性為中藥炮制的標準化和智能數字化奠定了一定的基礎。