不同儲存時間、加工及儲存對葉菜類飼料亞硝酸鹽含量影響研究

陳 明，江弘遠，曹 峰

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300）

葉菜類飼料是指自然水分含量＞60%的一類飼料，可以為畜禽提供豐富的維生素及礦物質來源。但是葉菜類飼料不合理的儲存及加工，會使亞硝酸鹽含量增多。亞硝酸鹽具有強氧化性，會對身體系統造成危害，長期攝入亞硝酸鹽，也會引發亞硝基化合物中毒[1]。因此，人們非常關注葉菜類飼料中的亞硝酸鹽污染，控制亞硝酸鹽的攝入以及何種方式能減少亞硝酸鹽的含量，正成為飼料安全衛生的重要因素[2]。2015年8月5日起，我國開始實施關于《蔬菜中硝酸鹽限量》的國家標準，此標準適用于葉菜類、莖菜類、瓜類、豆類、根菜類飼料。但是，葉菜類飼料中的硝酸鹽含量與其在各地區生長方式、施肥方式、各地區土壤條件、儲存條件和加工方式有關系，因此，不同地域的葉菜類飼料中的硝酸鹽含量可能會出現差別[3-4]。因此，檢測研究葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的多少及其變化規律，以及控制動物體攝入亞硝酸鹽量已成為至關重要的措施。試驗研究了5種葉菜類飼料在敞口儲存7 d，不同加工溫度（220、80℃），密封狀態下不同儲存溫度（20、5℃）對葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的影響，為養殖者飼養畜禽提供衛生健康的葉菜類飼料提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 葉菜類飼料樣品

參加試驗的葉菜類飼料種類分別是白菜、青菜、包菜、菠菜、生菜，均購買于江蘇省泰州市農貿市場。

1.1.2 試驗儀器

試驗儀器主要包括：UV-1700SPC型可見光分光光度計（上海美析儀器有限公司），BSA124S型普通分析天平（蘇州金鉆稱重設備系統開發有限公司），JJ224BC型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠），CH～06型便攜式榨汁機（深圳市寶安區沙井廣式電器廠）。

1.1.3 試劑及其濃度

亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）；乙酸鋅溶液（220 g·L-1）；飽和硼砂溶液（50 g·L-1）；60%乙酸溶液；對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）；鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）；氯化銨緩沖液；亞硝酸鈉標準溶液（220 μg·mL-1）；亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg·mL-1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 儲存時間

用自來水把各葉菜類飼料樣品洗干凈，去除爛葉及黃葉，再用去離子水把之前洗凈的葉菜類飼料樣品洗干凈，風干水分。將葉菜類飼料樣品儲存在室溫（20℃）的環境下，并在第1～7天每天分別測定5種葉菜類飼料樣品中的吸光度，并將吸光度帶入亞硝酸鈉標準曲線進行計算，得出亞硝酸鈉的含量。

1.2.2 加工方法

將洗凈的葉菜類飼料樣品進行加工處理，加工方法是放在鍋上炒制，溫度為220和80℃，按試驗步驟操作，最后對于處理好的待測液進行吸光度檢測，并計算出亞硝酸鈉的含量。放置24 h后，再次測定兩種葉菜類飼料樣品的吸光度值，并計算出亞硝酸鈉的含量。

1.2.3 不同儲存溫度

將葉菜類飼料樣品塑料袋密封，分別在常溫（20℃）和冷藏（5℃）環境下儲存1、2、3、4、5、6、7 d，每天8:00對密封儲存在室溫（20℃）和冷藏（5℃）環境下的5種葉菜類飼料分別進行采樣，共7 d，進行吸光度檢測，并計算出亞硝酸鈉的含量。

1.3 待測液的制備

稱取葉菜類飼料樣品10.00 g→放置在25 mL燒杯中→加飽和硼砂溶液12.5 mL（50 g·L-1）→攪拌均勻→精確加入70℃去離子水30 mL→100℃水浴鍋加熱15 min→取出冷卻至室溫→將試樣洗入250 mL容量瓶→加入亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）5.0 mL→搖勻→加入乙酸鋅溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精確加水至刻度，搖勻→放置30 min→上清液過濾，棄去初濾液30 mL→繼續過濾→吸取之后過濾所得濾液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混勻→靜置3～5 min→加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精確加超純水至刻度→混勻→靜置15 min，后留作測定吸光度所用。

1.4 亞硝酸鈉標準曲線的制作

用刻度吸管精確移取亞硝酸鈉標準使用液0、 0.10、 0.20、 0.30、 0.40、 0.50、 0.75、 1.00、1.25 mL→分別置于25 mL棕色容量瓶中→精確加去離子水至12.5 mL→分別加入對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2 mL→混勻→靜置 3～5 min后→各加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1 mL→精確加超純水至25 mL刻度，混勻→靜置15 min。用1 cm比色管，以黑色遮光體調節零點，于波長520 nm處測吸光度，以亞硝酸鈉的質量（m）為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標的標準工作曲線；其回歸線方程為y=0.1x+0.001 8，線性相關系數R2=0.997 8，之后每天所測吸光度均要帶入此方程進行計算。試驗數據如圖1所示。

圖1 亞硝酸鈉標準曲線

1.5 亞硝酸鈉含量的測定，采用文獻進行測定

稱取葉菜類飼料樣品10.00 g→放置在25 mL燒杯中→加飽和硼砂溶液（50 g·L-1）12.5 mL→攪拌均勻→精確加入70℃去離子水30 mL→100℃水浴鍋加熱15 min→取出冷卻至室溫→將試樣洗入250 mL容量瓶→加入亞鐵氰化鉀溶液（106 g·L-1）5.0 mL→搖勻→加入乙酸鋅溶液（220 g·L-1）5.0 mL→精確加水至刻度，搖勻→放置30 min→上清液過濾，棄去初濾液30 mL→吸取余下濾液20 mL于25 mL棕色容量瓶中→加入對氨基苯磺酸溶液（4 g·L-1）2.0 mL→混勻→靜置3～5 min→加入鹽酸萘乙二胺溶液（2 g·L-1）1.0 mL→精確加去離子水至刻度→混勻→靜置15 min，用1 cm比色管，以黑色遮光體調零，含亞硝酸鈉0.00 mg的試液作為對照，于波長520 nm處測吸光度。亞硝酸鈉含量的計算公式見式1。

式中，X為各葉菜類飼料試樣中亞硝酸鈉的含量，單位為mg·kg-1（換算而來）；m1表示測定用樣液（測完吸光度后帶入亞硝酸鈉標準曲線進行計算所得出的結果）中亞硝酸鈉的質量，單位為μg；m0表示試樣（每天稱量各葉菜類飼料樣品時的質量，精確記錄）的質量，單位為g；V1是測定用樣液的體積；V0是試樣處理液的總體積，單位為mL；以在重復前提下獲得的5次獨立測定結果的算術平均值表現出亞硝酸鈉的含量。

1.6 統計分析

試驗數據先用Excel進行初步處理，再用SPSS軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan's多重比較，結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 儲存時間對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

室溫敞口儲存葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量見表1。

由表1可知，在儲存溫度（室溫20～25℃），儲存方式（露天儲存）7 d中，白菜中亞硝酸鈉含量增加了 4×10-4mg，差異顯著（P＜0.05）；包菜、青菜、生菜中亞硝酸鈉含量增加了7×10-4～1.1×10-3mg，差異顯著（P＜0.05）；菠菜中亞硝酸鈉含量變化較大，尤其在第6天達到峰值，之后便開始呈下降趨勢，差異顯著（P＜0.05）。

不同葉菜類飼料7 d，在室溫敞口儲存下亞硝酸鈉含量的變化具體見圖2～6。

由圖2可知，第1～5天白菜中亞硝酸鈉的含量變化有著變化較為平穩的趨勢，第3～5天變化甚微，僅有2×10-5mg，第5～6天急劇上升，達到2.18×10-3mg，第6～7天變化甚微，僅有2×10-5mg。

由圖2可知，第1～4天，包菜中亞硝酸鈉的含量呈緩慢增加趨勢，第4～5天急劇上升，達到3×10-4mg，第5～6天變化甚微，僅有4×10-5mg，第6～7天變化較大，達到2×10-4mg。

由圖3可知，第1～4天，青菜中亞硝酸鈉含量變化不明顯，第4～5天，急劇上升，達到4×10-4mg，第5～7天變化較為平緩。

表1 室溫敞口儲存葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量

圖2 白菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

圖3 包菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

圖4 青菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

由圖4可知，第1～4天，生菜中亞硝酸鈉含量有著較為快速的增長趨勢，每天增加1×10-4mg，第4天作為一個分界點，第4～7天生菜中亞硝酸鈉含量增加趨勢較為平緩。

圖5 生菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

由圖5可知，第1～5天中菠菜中的亞硝酸鈉含量隨著天數的增加而呈現出緩慢上升趨勢，但增加甚微，在第5～6天亞硝酸鈉含量急劇上升，并在第6天達到峰值，在第6天后便呈下降趨勢。

圖6 菠菜7 d亞硝酸鈉含量的變化

2.2 兩種加工溫度對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

采用220和80℃對5種葉菜類飼料進行熱處理，亞硝酸鹽含量見表2，放置24 h后，5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量見表3。

由表2可知，兩種加工溫度下，5種葉菜類飼料在220℃比在80℃下亞硝酸鈉含量要高，包菜、菠菜最多，為1×10-3mg。白菜、青菜最少，為5×10-4mg。

表2 兩種加工溫度葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量 μg·kg-1

由表3可知，采用220和80℃放置24 h后，葉菜類飼料中亞硝酸鈉含量變化不大，生菜中亞硝酸鈉含量增加最多，增加1.7×10-3mg，青菜中亞硝酸鈉增加的最少，增加3×10-4mg，放置時間的增加會導致葉菜類飼料中亞硝酸鈉含量隨之上升。

2.3 不同儲存溫度對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

不同儲存溫度對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響見表4～5。

由表4可知，在常溫密封儲存下，白菜、青菜、包菜和菠菜的亞硝酸鹽含量在第2～3天均不存在顯著差異（P＞0.05）。生菜的亞硝酸鹽含量在的第4～5天均不存在顯著差異（P＞0.05），菠菜的亞硝酸鹽含量在的第1天與第2天均不存在顯著差異（P＞0.05）。

由表5可知，在冷藏儲存下，白菜和包菜的亞硝酸鹽含量在第1天和第2天均不存在顯著差異（P＞0.05），青菜、菠菜和生菜的亞硝酸鹽含量均差異顯著（P＜0.05）。

5種葉菜類飼料在兩種儲存溫度下亞硝酸鹽含量7 d的變化見圖8～11。

表3 兩種加工溫度放置24 h后葉菜類飼料中亞硝酸鈉的含量 μg·kg-1

表4 密封儲存條件下常溫（20℃）5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的變化

表5 冷藏（5℃）儲存條件下5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的變化mg·kg-1

圖7 白菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖9 包菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖11 生菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

4討論

4.1 不同儲存時間對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

試驗中5種葉菜類飼料儲藏7 d，亞硝酸鈉的含量隨天數的增加而增加，達到峰值后便有所下降，尤其以菠菜最為明顯，新鮮菠菜中亞硝酸鈉含量很低，在常溫露天儲存下，菠菜中亞硝酸鈉含量隨天數增加而增加，在前5 d呈現出緩慢上升趨勢，在第6天達到峰值，并尤其明顯，亞硝酸鈉含量是第5天的9倍之多，之后便呈現下降趨勢。

在試驗中，儲存時間（0～6 d）及儲存溫度（室溫20～25℃）對葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的影響，根據林周孟等人的存放時間及存放溫度對葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響的研究可知，在0～6 d的儲存時間中，隨著儲存時間的延長，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量均呈增加趨勢，但含量和增加趨勢有所差異，由于試驗天數相對較少，但可以得出，白菜青菜包菜生菜中亞硝酸鹽含量隨著天數增加而所呈現出的增長趨勢大致相同，但菠菜的亞硝酸鹽含量，前5 d增長趨勢較為緩慢，在第6天達到峰值，之后便呈現下降趨勢。不同種類的葉菜類飼料亞硝酸鹽含量存在較大差異[5]。從測定的5種葉菜類飼料來分析，根據徐貴華等做的存放時間對葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的試驗，在正常儲存時間（0～6 d）內以及在正常儲存溫度（室溫20～25℃）下，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量的積累均不會超過飼料衛生標準（≤4 mg·kg-1）[6]。

圖8 青菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

圖10 菠菜兩種溫度放置7 d NO2-含量變化比較

4.2 不同加工方式對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

根據梁斌的加工方法及加工后的存放時間對葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響的研究，可知不同的加工方式對不同的葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量也有不同的影響[7]。熱處理220℃的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量均比熱處理80℃下的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量要高5×10-4～1×10-3mg。根據呂元楷的隔夜菜中亞硝酸鹽含量的分析研究和張麗華等的葉菜類飼料中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量分析與評價，熱處理220℃放置24 h后，白菜，青菜中亞硝酸鹽含量要比熱處理80℃放置24 h高3×10-4～8×10-4mg，包菜、生菜、菠菜中亞硝酸鹽含量要比熱處理80 ℃放置24 h高3×10-4～1.7×10-3mg[8-9]。

4.3 不同儲存溫度對5種葉菜類飼料亞硝酸鹽含量的影響

葉菜類飼料在常溫密封儲存的過程中隨著放置時間的延長逐漸增高，而且在第3～4天葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量出現急速增長，第5天，葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量下降，第6天達到最大值，然后再次下降。其原因可能是葉菜類飼料中的硝酸鹽和亞硝酸鹽在一定條件下相互轉化，導致亞硝酸鹽含量降低[10]。這與王子云等試驗結果的變化規律基本一致[11]。菠菜和青菜在常溫密封儲存的第5天時便開始出現腐葉，說明在常溫下葉菜類飼料不宜儲存時間過長。

冷藏儲存下的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量在1～3 d的時候變化不大，亞硝酸鹽含量在3～4 d的時候急劇增長，在第6天時達到峰值。但冷藏儲存下的葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量較低一些，可能是因為在冰箱內低溫冷藏的條件下不利于微生物的生長，這與魏穎等的研究結果一致[12]。其中菠菜、青菜和生菜在3～4 d的增長變化較其他的而言增長的變化比較大。

5結論

在室溫（20～25℃）敞口儲存條件下，葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量隨著天數的增加而增加。不同加工方式下，熱處理220℃的葉菜類飼料中亞硝酸鹽含量要高于熱處理80℃的葉菜類飼料亞硝酸鹽含量，放置24 h后，煮熟葉菜類飼料中的亞硝酸鹽含量明顯提高，不同儲存溫度下葉菜類飼料的亞硝酸鹽含量的峰值大小順序為常溫密封儲存＞冷藏。因此，依據《飼料衛生標準》（2018年5月1日頒布），葉菜類飼料適宜在4 d內飼喂。另外，葉菜類飼料不適合過夜飼喂。儲存葉菜類飼料類飼料是最好是選擇低溫冷藏的儲存方式，但儲存的時間不宜太長，應≤3 d。