靶向NSCLC EGFR exon20插入突變的新抗原疫苗篩選和功能研究

劉丹丹 韓雷 于津浦

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中常見的驅動基因［1］，其突變發(fā)生率約占東南亞NSCLC患者的40%～60%［2-3］。研究表明EGFR 突變與NSCLC 患者接受EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療后臨床療效之間存在顯著相關性［4］。但是，在眾多EGFR 突變中，10%～12%為EGFR exon20 非移碼性框內插入突變（exon20 insertions，20ins）［5-7］，其中90%的EGFR 20ins 位于C-螺旋終止點之后，表現(xiàn)為對EGFR-TKI 的原發(fā)耐藥［8-10］。近年來，雖然免疫檢查點抑制劑在NSCLC 治療中發(fā)揮了越來越重要的作用，但其對攜帶EGFR 20ins 的NSCLC 患者治療效果并不理想［11-12］，需要尋求新的免疫治療手段。

腫瘤新生抗原（tumor neoantigens，TNAs）疫苗的研究［13］可能為EGFR 20ins陽性NSCLC患者提供免疫治療的機會。TNAs免疫治療是通過生物信息學篩選出具有抗原性的腫瘤內源性基因突變，鑒定出此基因突變對應的TNAs，然后用此抗原刺激抗原特異性T 淋巴細胞大量增殖活化，以達到殺滅腫瘤細胞、令腫瘤消退的目的。目前，大多數(shù)TNAs 來源于罕見的非同義單核苷酸突變、框移突變、剪接變異和基因融合，缺乏針對框內移碼突變的TNAs 疫苗研究［14］。本研究首次針對NSCLC中常見的EGFR 20ins設計靶向NSCLC 的TNAs，并通過細胞實驗和動物模型證實其能夠誘導特異性T淋巴細胞擴增和活化，識別并殺傷NSCLC 細胞，旨在為攜帶EGFR 20ins 的難治性NSCLC患者提供新的免疫治療手段。

1 材料與方法

1.1 細胞和材料

1.1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液（購自美國Corning公司）；胎牛血清（購自以色列Biological Industries公司）；細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、rhIL-2、rmGMCSF、rmIL-4、rmTNF-α、rmIL-2（購自美國PeproTech公司）；鼠抗人單克隆抗體4-1BB、CD25、CD3/4/8、IFN-γ（購自美國Biolegend公司）；Cytofix/CytopermTMPlus試劑盒（購自美國BD公司）；CellTraceTMCFSE試劑盒（購自美國invitrogen公司）；Zombie NIR染料（購自美國BioLegend公司）；人和小鼠淋巴細胞分離液（購自北京索萊寶科技有限公司）；Elispot試劑盒（購自北京達科為生物技術有限公司）。

1.1.2 細胞 人外周血單核細胞由HLA-A*02 健康供者捐贈；小鼠肺腺癌（lewis lung cancer，LLC）細胞株（購自廣州賽庫生物技術有限公司）培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.3 實驗動物 4～6周齡雌性C57BL/6小鼠（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司），體質量16～22 g，在SPF級條件下飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 HLA-A*02限制性EGFR 20ins表位肽的預測與設計合成 搜集NSCLC 相關文獻及COSMIC 數(shù)據(jù)庫（https：//cancer.sanger.ac.uk/cosmic）中EGFR 20ins的突變類型。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取EGFR蛋白質序列（NP_005219.2），根據(jù)插入位置形成exon20突變序列，使用IEDB（http：//tools.iedb.org/mhci/）［15］、NetMHC4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）［16］和SYFPEITHI（htt p：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）［17］軟件對突變序列進行預測評分。參數(shù)設定：細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）表位限制性MHC類型為HLA-A*02：01，預測表位肽長度為9～10氨基酸。根據(jù)預測評分篩選最具優(yōu)勢的抗原表位，設計一條短肽E-ASV-10和一條長肽E-ASV-19。多肽由上海生工生物工程有限公司合成，合成后進行脫鹽處理，純度≥95%，高效液相色譜及質譜證實其相對分子質量符合理論值。將合成多肽干粉溶解后，用無菌水配制成1 mg/mL的無菌溶液備用。

1.2.2 負載表位肽的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）誘導CTL 采集健康人外周血50 mL，加入淋巴細胞分離液Ficoll 離心分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），貼壁2 h 后，添加1 000 U/mL rhGM-CSF 和1 000 U/mL rhIL-4 培養(yǎng)6天。第3天半量換液并補充全量細胞因子。第6天加入1 000 U/mL rhTNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察形態(tài)，收集DCs，臺盼藍染色，計數(shù)。收集自體淋巴細胞，與DCs以5：1比例混合，并加入1 000 U/mL rhIL-2和20 μg/mL 的多肽共培養(yǎng)48 h，收集細胞，臺盼藍染色，計數(shù)。

1.2.3 流式細胞術法檢測T 細胞表型 取部分抗原肽刺激后的淋巴細胞加入鼠抗人4-1BB-PE 和CD25-APC單抗染色，室溫避光孵育30 min后PBS洗滌重懸細胞，流式檢測4-1BB+CD25+T 細胞比例。取部分抗原肽刺激后的淋巴細胞，加入高爾基體蛋白轉運體阻斷劑，于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～6 h 后，加入CD3-PerCP-CyTM5.5/CD4-FITC/CD8-PE單克隆抗體，室溫避光孵育20 min。通透洗滌緩沖液洗滌，加入Cytofix/Cytoperm室溫避光孵育20 min。通體緩沖液洗滌細胞后加入IFN-γ-APC 單抗染色，室溫避光孵育20 min，PBS 洗滌重懸細胞，流式檢測IFN-γ分泌細胞比例。

1.2.4 酶聯(lián)免疫斑點法檢測T 細胞中IFN-γ 的分泌 在酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）實驗孔板中加入200 μL 無血清培養(yǎng)基進行封閉，靜置5～10 min后棄去孔內液體。將刺激后淋巴細胞濃度調整至2.5×106/mL，每孔加入0.1 mL，37℃5%CO2孵育24 h。傾倒孔內培養(yǎng)基，加入預冷4℃的去離子水，200 μL/孔，4℃冰箱放置10 min，裂解細胞。棄去孔內液體，加入Washing Buffer（1×），200 μL/孔，放置1 min后洗滌6次。加入生物素標記的抗體工作液（100 μL/孔），37℃5%CO2孵育1 h 后洗滌，方法同上。加入酶標親和素工作液（100 μL/孔），37℃5%CO2孵育1 h 后洗滌，方法同上。加入現(xiàn)配AEC 顯色液（100 μL/孔），室溫避光靜置10～20 min，用水洗滌3～5 次，終止顯色，放置陰涼處自然晾干后，應用ELISPOT圖像分析儀進行斑點計數(shù)。

1.2.5 多肽誘導C57BL/6 小鼠抗原特異性 CTL C57BL/6 小鼠脫頸處死后，無菌取股骨骨髓，計數(shù)后培養(yǎng)于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。在貼壁細胞中添加rmGM-CSF和rmIL-4后培養(yǎng)DCs。同時，取小鼠脾T細胞與DCs以5：1 比例混合，并加入20 μg/mL 的多肽進行抗原負載，共孵育后收集計數(shù)CTL細胞，檢測IFN-γ的分泌。

1.2.6 構建攜帶V769_D770insASV的小鼠NSCLC細胞LLCasv通過基因重組構建含有V769_D770insASV的小鼠EGFR全長序列的重組GV492質粒，測序正確克隆包裝慢病毒。將LLC 細胞加入96 孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)24 h，至細胞融合率為20%～30%，加入病毒感染增強液97 μL，慢病毒（1×108/mL）0.003 mL，輕搖混勻，37℃5%CO2培養(yǎng)12 h后換液，轉染72 h檢測轉染效率。抗性篩選V769_D770insASV 突變陽性細胞，有限稀釋法建立穩(wěn)定轉染細胞系LLCasv。

1.2.7 小鼠淋巴細胞殺傷實驗 收集多肽誘導后C57BL/6小鼠的CTL作為效應細胞。將靶細胞LLCasv計數(shù)后接種于6 孔板中，加入CSFE，室溫避光孵育20 min。洗滌細胞后將效應細胞和靶細胞以10：1、2 0：1比例進行共培養(yǎng)，每組設置3個復孔。共孵育4 h后收集細胞于流式管中。每管加入100 μL NIRZombie 染液，室溫閉光孵育20 min，離心洗滌后用200 μL 1%多聚甲醛重懸，BD FACSCanto Ⅱ分析型流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。應用Graph-Pad Prism軟件進行繪圖。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 表位預測結果篩選及設計

根據(jù)文獻和公共數(shù)據(jù)庫信息，V769_D770insASV（19.35%）為高頻率EGFR 20ins 突變類型［5，18-19］。通過IEDB、NetMHC 4.0 和SYFPEITHI 軟件預測EGFR 20ins中V769_D770insASV的潛在HLA-A*02限制性CTL 表位，篩選出各軟件中評分較高的表位肽（表1）。其中YV-9 與HLA-A*02：01 具有較好的結合力，因此基于此核心序列設計E-ASV-10 和E-ASV-19多肽疫苗，同時選取相應EGFR野生型肽段E-WT進行合成。

2.2 流式細胞術檢測多肽刺激后T細胞的表型變化

分別設立實驗組1（E-ASV-10 肽致敏T 細胞，TE-ASV-10）和實驗組2（E-ASV-19肽致敏T細胞，TE-ASV-19），空白對照組（含1 000 U/mL rhIL-2的完全培養(yǎng)基RPMI 1640），無肽對照組（空白T細胞，T）、陰性肽對照組（野生型EGFR 20 外顯子肽致敏T 細胞，TE-WT），和陽性對照組（PHA刺激的人T細胞或PMA刺激的小鼠T細胞，Tpositive），下同。采用流式細胞術，以單克隆抗體CD25 和4-1BB 標記T 細胞，檢測EASV-10和E-ASV-19多肽與人DC細胞共孵育后，人T 淋巴細胞活化的情況。經(jīng)E-ASV-10 刺激后的TE-ASV-10細胞和E-ASV-19 刺激后的TE-ASV-19細胞比未接觸抗原肽刺激的T 細胞和負載野生型肽刺激的TE-WT 細胞活化水平均增高，即4-1BB+CD25+細胞數(shù)量增加（P＜0.05，圖1A）。同時以CD3、CD4、CD8抗體標記不同T 細胞亞群，檢測E-ASV-10 和E-ASV-19 多肽誘導的T 細胞特異性IFN-γ 分泌情況。流式細胞術分析結果顯示CD4+和CD8+T細胞活化比例亦增多，IFN-γ的分泌增加（P＜0.05）（圖1B，C），表明EASV-10和E-ASV-19均可在體外刺激T淋巴細胞的擴增和活化。

表1 EGFR V769_D770insASV HLA-A*02：01 限制性CTL 表位預測結果

2.3 酶聯(lián)免疫斑點法檢測T細胞中IFN-γ分泌

利 用ELISPOT 檢 測E-WT、E-ASV-10 和EASV-19 多肽與人DC 細胞共孵育后人T 淋巴細胞分泌IFN-γ 的情況。結果顯示，ELISPOT 實驗中PHA刺激的陽性對照組Tpositive 細胞分泌IFN-γ 形成的點數(shù)過多。其中E-ASV-10 刺激后的TE-ASV-10細胞和E-ASV-19 刺激后的TE-ASV-19細胞均可特異性分泌IFN-γ（圖2，表2）。并且隨著T細胞抗原負載次數(shù)的增加，T淋巴細胞分泌IFN-γ量也隨之增加，E-ASV-10 抗原負載3 次的TE-ASV-10-3細胞較負載2 次的TE-ASV-10-2細胞分泌IFN-γ增多（P＜0.05），同樣E-ASV-19 刺激的TE-ASV-19-3較TE-ASV-19-2細胞分泌IFN-γ 增多（P＜0.05）。結果顯示E-ASV-10 和E-ASV-19 均可在體外誘導出識別相應EGFR exon20 插入突變的TNA抗原的特異性T淋巴細胞。

2.4 動物實驗

將小鼠骨髓來源DC 細胞與E-ASV-10 共孵育，在體外誘導小鼠CTL 細胞，并通過ELISPOT 法檢測E-ASV-10誘導小鼠CTL活性。結果顯示E-ASV-10均可以刺激C57BL/6 小鼠CTL 細胞活性（圖3A），并特異性分泌IFN-γ（P＜0.05）。同時，體外誘導CTL細胞與攜帶EGFR V769_D770insASV的LLC細胞系LLCasv 共培養(yǎng)時，在效靶比為20：1 時可顯著殺傷靶細胞（P＜0.05，圖3B），表明E-ASV-10 可誘導特異性靶向攜帶相應EGFR 20ins細胞的殺傷性T細胞。

圖1 流式細胞術檢測E-ASV-10和E-ASV-19多肽體外誘導人T淋巴細胞的增殖和活化

圖2 E-ASV-10和E-ASV-19體外誘導人T淋巴細胞分泌IFN-γ

表2 候選表位肽體外誘導人T淋巴細胞分泌IFN-γ的ELISPOT實驗結果

圖3 E-ASV-10體外誘導小鼠特異性殺傷T細胞的活性檢測

3 討論

TNAs疫苗作為一種主動免疫療法，通過激活機體免疫系統(tǒng)產生抗腫瘤免疫應答［20］。相關TNAs疫苗治療的研究成果［21-22］證明其能夠引發(fā)免疫應答反應。但大多數(shù)TNAs來源于罕見的基因結構變異，發(fā)生頻率較低，不利于通用型TNAs疫苗的研發(fā)［14，20，23］。目前，尚未有報道靶向發(fā)生頻率較高的熱點基因突變的TNAs疫苗制備，如EGFR 20ins。因此本研究設計靶向EGFR 20ins 的TNAs多肽E-ASV-10和E-ASV-19，通過細胞實驗首次證實E-ASV-10和E-ASV-19具備誘導特異性T淋巴細胞擴增和活化、識別并殺傷攜帶相應EGFR exon20插入突變NSCLC細胞的活性，并提出TNAs多肽E-ASV-10和E-ASV-19可作為一種新的腫瘤疫苗用于治療攜帶相應基因變異的NSCLC的潛在臨床應用前景。

4-1BB是T細胞協(xié)同刺激分子，主要表達于活化的T細胞。CD25分子是IL-2R的α鏈，對形成高親和力受體有重要意義，主要分布于活化的T細胞表面。故采用流式細胞術檢測E-ASV-10和E-ASV-19多肽與人DC細胞共孵育后人T淋巴細胞活化，即單克隆抗體CD25和4-1BB標記的T細胞活化程度。同時以CD3、CD4、CD8抗體標記T細胞，檢測細胞內IFN-γ的含量。結果顯示多肽E-ASV-10和E-ASV-19在體外可誘導HLA-A*02限制性T細胞的擴增和活化，上調4-1BB+CD25+細胞比例，促進CD4+、CD8+T細胞IFN-γ的合成和釋放。

小鼠EGFR 基因（NP_997538.1）和人EGFR 基因（NP_005219.2）高度同源，在EGFR20外顯子V769_D770 insASV突變前后90AA范圍內（L704-P794）堿基序列100%同源，生物分析軟件預測E-ASV-10多肽可同小鼠H-2Kb和H-2Kd分子結合，提示E-ASV-10可刺激C57BL/6小鼠（H-2Kb）和Balb/c小鼠（H-2Kd）產生特異性殺傷T細胞。本研究選取C57BL/6小鼠骨髓來源DC細胞與E-ASV-10共孵體外誘導小鼠CTL細胞，通過與攜帶EGFR V769_D770insASV的LLCasv細胞系共培養(yǎng)，證實了多肽E-ASV-10體外可刺激C57BL/6小鼠的T細胞分泌IFN-γ，對攜帶V769_D770insASV的小鼠NSCLC細胞LLCasv具有殺傷活性。

本研究設計的多肽E-ASV-10和E-ASV-19能夠在體外誘導特異性靶向攜帶V769_D770insASVNSCLC細胞的殺傷性T細胞，但仍然存在一些局限性。首先，由于本研究主要通過細胞實驗和小鼠移植瘤模型進行論證，實驗方法比較單一，后續(xù)將通過采集EGFR 20ins NSCLC患者原代組織構建小鼠PDX模型來對實驗結果進行進一步驗證。其次，針對TNAs的設計仍需優(yōu)化，如提高CTL表位的免疫原性、克服人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）限制性、延長多肽的長度以及改善HLA的低表達等［24-25］。大多數(shù)免疫療法集中于通過直接激活效應T細胞或減輕其抑制來增強免疫應答，而腫瘤可以降低MHC-Ⅰ分子的表達，從而使腫瘤細胞逃逸機體的免疫監(jiān)視，并增加免疫抑制性受體的表達［26］。因此，上調MHC-Ⅰ分子和靶細胞上的抗原呈遞對于適應性免疫反應必不可少。通過調節(jié)有限抗原的表達，結合靶向調節(jié)MHC-Ⅰ通路的分子，如靶向NF-κB［27］、IL6/STAT3［28］和MAPK［29］的抑制劑等，可以開發(fā)出新的協(xié)同治療策略，有望改善臨床療效。

總之，本研究通過生物信息分析和功能實驗，證實E-ASV-10和E-ASV-19多肽不僅在體外誘導人HLAA*02限制性T細胞的擴增和活化，而且在C57BL/6小鼠可誘導特異性靶向攜帶V769_D770insASV突變的LLC肺癌的殺傷性T細胞，提示其作為一種新的腫瘤疫苗用于治療攜帶相應EGFR exon20插入突變的NSCLC具有潛在臨床應用前景，為肺癌免疫治療提供新思路。