酸堿滴定法解決綿羊凍精稀釋液卵黃沉淀試驗

肖廣慶，李新月，劉欣偉

（1.洛陽市畜牧良種繁育推廣中心，河南 洛陽471013；2.河南科技大學）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 器材

采精器材（假陰道、水浴鍋、集精杯、保定架），精液檢測（顯微鏡、密度儀、水浴鍋），酸堿滴定（酸度儀、定量滴定管、定量瓶），凍精生產（細管灌裝機、冷凍儀、冰箱、冰柜）。

1.1.2 種羊

洛陽市畜牧良種繁育推廣中心種羊場肉用種公羊。

1.1.3 稀釋液

羊凍精稀釋液配方主要成分：三羥甲基氨基甲烷、糖類、檸檬酸鈉、檸檬酸、卵黃、甘油、抗生素。經測基礎液pH值為6.42，稀釋液pH值為6.45。

1.1.4 標準pH值溶液

氫氧化鈉（pH值為13）。

1.2 試驗方法

先用氫氧化鈉溶液滴定10 ml 基礎液，滴定時記錄每次滴定量（用0.2 ml滴定管或移液槍），滴定后搖勻用酸度儀測量pH，測3 次記錄平均值，直至較理想pH 值（6.6～6.9），計算滴定量，超過2 ml，則用較高濃度氫氧化鈉溶液替代，換算滴定量直接滴定。調好pH值后的基礎液加甘油、卵黃配制成品稀釋液，安排采精、冷凍，觀察活力情況，并與滴定前配方稀釋液進行對比。

1.3 pH值測定

酸度儀使用前要用標準液校準，誤差在規定范圍方可測定。測定時待測液最好放水浴鍋中，水浴鍋溫度與室溫一致，在酸度計允許范圍即可，記錄時3 次測定取平均值。具體滴定情況見表1：

表1 10 ml基礎液用標準氫氧化鈉液滴定情況

由表1 可知：10 ml 基礎液滴定0.1 ml NaOH 溶液pH值為6.83，為較理想中性偏酸環境。配制100 ml基礎液可用1 ml NaOH溶液校準。

1.4 試驗組與對照組稀釋液配制

試驗組稀釋液用滴定后基礎液（100 ml 原基礎液加1 ml NaOH）加卵黃、甘油配制。對照組用滴定前基礎液加卵黃、甘油配制。配好后放冰箱（0～4 ℃）保存。

2 結果與分析

2.1 冰箱存放一晚稀釋液情況

試驗組卵黃沉淀較少，對照組出現大量卵黃沉淀，沉淀均為乳白色顆粒沉淀。搖勻后鏡檢試驗組卵黃滴布滿視野，對照組有少量卵黃滴但不影響視野清晰度。

2.2 羊精液稀釋、平衡、冷凍后活力情況（表2）

表2 羊精液稀釋、平衡、冷凍后活力情況

羊鮮精用兩種稀釋液稀釋后放0～4 ℃冰柜平衡4 h、用細管灌裝冷凍后觀察活力情況。

由表2 可知：對照組平衡后活力高于試驗組，冷凍后卻低于對照組。說明，酸堿滴定雖然可以改變卵黃沉淀，但精子活力下降，并且在顯微鏡下放置10 多分鐘后出現大量聚集死亡現象。［1-2］

3 討論

羊凍精稀釋液pH 值是導致卵黃沉淀的因素之一，但調整pH值后仍有少量沉淀，說明導致卵黃沉淀的因素除基礎液pH值外還有其他因素存在。

單純用酸堿滴定方法調整基礎液pH值可能改變稀釋液電離平衡，導致精子產生凝聚反應而大量死亡。

稀釋液中加有三羥甲基氨基甲烷等緩沖物質，酸堿滴定降低稀釋液的緩沖性，導致精子凍傷或死亡，降低凍后活力。如果改用三羥甲基氨基甲烷滴定校準基礎液酸堿度可能更為合適。