低海拔地區黑苦蕎酚類物質含量、組成及抗氧化活性研究

孫坤坤　侯澤豪　魏淑東　方正武

摘要：? 為探究黑苦蕎的市場利用價值，該研究選擇種植于湖北江漢平原低海拔地區的川蕎1號和九江苦蕎作為材料，分析苦蕎籽粒中游離酚、結合酚、總酚、游離黃酮、結合黃酮和總黃酮的含量，利用DPPH自由基法、ABTS自由基法和鐵離子還原抗氧化法（FRAP）三種抗氧化測試模型綜合評價其體外抗氧化活性，并運用高效液相色譜（HPLC）技術對其酚類物質的組成進行鑒定。結果表明：（1）川蕎1號籽粒的總酚和總黃酮含量顯著高于九江苦蕎，分別為27.38 mg GAE·g-1 DW、31.46 mg RE·g-1 DW和12.71 mg GAE·g-1 DW、14.68 mg RE·g-1 DW;其中游離酚與游離黃酮含量顯著高于結合酚與結合黃酮含量，均占總酚和總黃酮含量的79%以上，且九江苦蕎中結合酚和結合黃酮的含量高于川蕎1號。（2）苦蕎籽粒中酚類物質主要由蘆丁、槲皮素、表兒茶素、山奈酚、山奈酚-3-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-吡喃葡萄糖苷等黃酮類化合物組成，其中游離酚以蘆丁和槲皮素為主，結合酚以表兒茶素和蘆丁為主。（3）苦蕎籽粒提取物均具有一定的抗氧化活性，黑苦蕎川蕎1號游離態DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力值分別為30.14、11.03、18.84 mg TE·g-1 DW，高于九江苦蕎，而結合態三種抗氧化能力值低于九江苦蕎，但黑苦蕎川蕎1號總抗氧化能力顯著高于九江苦蕎。在低海拔地區江漢平原，種植的黑苦蕎川蕎1號籽粒具有較高含量的酚類物質，符合后續的食品加工的生產要求，市場開發前景廣闊。

關鍵詞： 黑苦蕎， 游離酚， 結合酚， 高效液相色譜， 抗氧化活性

中圖分類號：? Q945文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）02-0210-08

Abstract：? In order to explore the market value of black tartary buckwheat，? we analyzed the phenolics and antioxidant activities of Chuanqiao 1 and Jiujiang Kuqiao， two tartary buckwheat varieties planted in the low-elevation regions of the Jianghan Plain of Hubei， determined the contents of free， bound and total phenolics and flavonoids， and we analyzed the antioxidant activities of their seed extracts? in vitro using the DPPH free radical， ABTS free radical and iron ion reduction antioxidant （FRAP） assays， and we also determined the phenolic compositions of the seed extracts by the high performance liquid chromatography （HPLC）. The results were as follows： （1） The contents of total phenolics and total flavonoids were significantly higher in the seeds of Chuanqiao 1 than those of Jiujiang Kuqiao， with the former standing at 27.38 mg GAE·g-1 DW and 31.46 mg RE·g-1 DW and the latter at 12.71 mg GAE·g-1 DW and 14.68 mg RE·g-1 DW ; in the seeds of the two varieties， the contents of the free phenolics and flavonoids， which made up more than 79% of the total phenolics and flavonoids， were significantly higher than those of bound phenolics and flavonoids; the contents of bound phenolics and flavonoids were higher in the seeds of Jiujiang Kuqiao than those of Chuanqiao 1. （2） Rutin， quercetin， epicatechin， kaempferol， kaempferol-3-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside-3′-O-glucopyranoside dominated among the phenolic compounds in the seeds of the black tartary buckwheat varieties， with rutin and quercetin dominant phenolics among the free phenolic compounds and epicatechin and rutin dominant among the bound ones. （3） All the seed extracts of the tartary buckwheat varieties presented antioxidant activities and the antioxidant activities of the free seed extracts of Chuanqiao 1， determining as being 30.14， 11.03 and 18.84 mg TE·g-1 DW using DPPH， ABTS and FRAP， respectively， were higher than those of Jiujiang Kuqiao. The antioxidant activities of the bound extracts of Chuanqiao 1 were lower than those of Jiujiang Kuqiao， but the total antioxidant acti-vity of the former variety was significantly higher than that of the latter one. Therefore， planted in low-elevation regions of the Jianghan Plain， Chuanqiao 1 had higher contents of seed phenolic compounds， as being required in subsequent food processing and presenting a bright market prospect.

Key words： black tartary buckwheat， free phenolics， bound phenolics， high performance liquid chromatography （HPLC）， antioxidant activity

蕎麥分甜蕎（Fagopyrum esculentum）和苦蕎（F. tataricum）兩個栽培種，集中分布在我國華北、西北和西南等地區（侯建霞，2007）。隨著人們生活水平的不斷提高和健康飲食觀念的增強，以苦蕎為原料的加工產品越來越受到消費者的青睞，這主要是與其富含多種營養物質，如蛋白質、維生素和多酚等有關（Zhu，2016）。植物多酚是植物代謝過程中產生的一類次生物質，主要以游離態和結合態的形式存在于植物細胞中（邵雅芳，2014;顏才植等，2015）。游離酚是可被有機溶劑提取的酚類物質，而結合酚是以共價鍵的形式與植物體相結合，不能被有機溶劑直接提取（Pe′rez-Jime′nez & Torres，2011）。盡管已有研究報道苦蕎中總酚、總黃酮的含量及其抗氧化活性（李海萍，2010;劉琴等，2014;周曉婷，2017），但是這些報道多集中于分析可被有機溶劑提取的游離酚部分，而對于結合態酚類物質的結構特征及其生物活性還很少涉及。Adom & Liu（2002）研究發現，玉米、小麥、大米等谷物中的酚類物質主要是以結合酚的形式存在。Liu（2007）認為，相對于游離酚，結合酚經過腸道微生物發酵作用后可能具有更高的生物活性。因此，系統分析苦蕎多酚的存在形式、結構組成對加強苦蕎功能開發具有重要意義。

Klepacka et al.（2011）和鄧浩（2014）發現，多酚類物質的含量和抗氧化活性與其品種和種植環境密切相關。國旭丹等（2019）研究表明，地區環境如海拔、降水量和日照時間等會顯著影響苦蕎多酚的含量。Guo et al.（2011）也發現生長環境以及品種與環境之間相互作用可能對苦蕎多酚物質的積累和抗氧化活性產生影響。但是隨著當前農業結構調整，發展綠色食品和農民增收的需要，低海拔平原地區的小宗糧豆作物的生產重新引起了重視。基于此，本研究在低海拔地區種植川蕎1號黑苦蕎和九江苦蕎兩個品種，分析其籽粒中游離酚和結合酚的含量、組成及其抗氧化活性進行分析，旨在揭示低海拔地區黑苦蕎中酚類物質存在的形式和結構特征，以期為低海拔平原地區生產的黑苦蕎深加工和品種優化提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料試驗于2018年8月15日在湖北省江漢平原長江大學農業科研基地（112°15′ E、30°36′ N，海拔34 m）進行，該試驗基地土壤以重壤和粘土為主，養分高，土地平整，水源排灌方便，前茬為大豆。土壤pH為7.60左右，有機質2.93%，全氮0.16%，有效磷和有效鉀分別為16.63和104.74 mg·kg-1。供試品種為川蕎1號和九江苦蕎，條播，正常田間管理，11月份收獲，種子曬干后，經人工去殼、冷凍干燥、加工，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 試劑與儀器試劑：山奈酚-3-蕓香糖苷（Kaempferol-3-rutinoside）購自于ApexBio公司;山奈酚（kaempferol）、表兒茶素（epicatechin）、槲皮素（quercetin）、沒食子酸（gallic acid，GA）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1， l-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH·）、2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽 [2， 2′-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、三吡啶基三嗪（TPTZ）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）等購自于Sigma 公司;色譜純乙腈、乙酸和標準品蘆丁（rutin）購自于麥克林公司;其他試劑均為市售分析純。

儀器：Allegra X-30R系列離心機（美國貝克曼庫爾特公司），N-1200B旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），真空冷凍干燥機（德國Martin Christ公司），雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 游離酚的提取參考Perales-Sánchez et al.（2014）的方法并略有修改。1 g蕎麥粉加入8 mL正己烷，充分震蕩，4 ℃、4 000 ×g下離心10 min后去除上清液，重復3次。再向沉淀中加入8 mL 80%乙醇，室溫下浸提30 min，每隔10 min震蕩一次，4 ℃、4 000 ×g下離心10 min后取上清液，同樣步驟重復3次，合并浸提液，37 ℃下旋轉蒸發近干，用80%乙醇定容至5 mL，-20 ℃保存備用。

1.2.2 結合酚的提取參照Sun et al.（2002）的研究方法，首先向上述游離酚提取殘渣中加入20 mL 2 mol·L-1 NaOH，在氮氣條件下室溫震蕩水解1～2 h后，其次用6 mol·L-1 HCl將pH調至1.5～2.0之間，最后在溶液中加入10 mL乙酸乙酯進行萃取，4 ℃、4 000 ×g下離心10 min收集乙酸乙酯部分，重復5次，合并有機溶劑，37 ℃下旋轉蒸發干，用50%甲醇復溶并定容至5 mL，-20 ℃保存備用。

1.2.3 總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定川蕎1號和九江苦蕎籽粒中總酚的含量（Julkunen-Tiitto，1985）。以沒食子酸為標準當量表示總酚的含量（mg Gallic acid eq·g-1干重樣品），簡寫為mg GAE·g-1 DW。

1.2.4 黃酮含量測定采用NaNO2-AlCl3·6H2O方法測定川蕎1號和九江苦蕎籽粒中總黃酮的含量（Jia et al.，1999）。以蘆丁為標準當量表示總黃酮的含量（mg Rutin eq·g-1干重樣品），簡寫為mg RE·g-1 DW。

1.2.5 HPLC法測定酚類物質組成及含量苦蕎提取物酚類物質的組成參照Jiang et al.（2015）建立的方法，結果以mg·g-1表示。對于槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷，其含量以蘆丁為標準表示。

1.2.6 抗氧化性測定

1.2.6.1 DPPHDPPH自由基清除能力的測定參考Brand-Williams et al.（1995）研究方法。DPPH值以每1 g干重樣品中奎諾二甲基丙烯酸酯當量（Trolox）表示，單位為mg Trolox eq·g-1干重樣品，簡寫為mg TE·g-1 DW。

1.2.6.2 ABTSABTS自由基清除能力的測定參照Re et al.（1999）的研究方法。ABTS以每1 g干重樣品中奎諾二甲基丙烯酸酯當量（Trolox）表示，單位為mg Trolox eq·g-1 干重樣品，簡寫為mg TE·g-1 DW。

1.2.6.3 FRAPFRAP還原抗氧化能力的測定參照Benzie & Strain（1996）研究方法。FRAP值以每1 g干重樣品中奎諾二甲基丙烯酸酯當量（Trolox）表示，單位為mg Trolox eq·g-1 干重樣品，簡寫為mg TE·g-1 DW。

1.3 數據處理與分析

利用Excel 2013和SPSS 19.0 軟件進行數據統計和分析，每個處理重復3次，數據以平均值±標準差（x±s）表示，使用線性回歸分析進行多酚和黃酮與抗氧化能力之間的相關分析。

2結果與分析

2.1 苦蕎產量和產量性狀

由表1可見，川蕎1號和九江苦蕎單株粒數約為117，無顯著差異;但九江苦蕎的千粒重（19.13 g）顯著高于川蕎1號（18.24 g），且其產量顯著高于川蕎1號，超出5%。

2.2 多酚和黃酮含量

由圖1：A可見，川蕎1號籽粒中游離酚含量（25.29 mg GAE·g-1 DW）顯著高于九江苦蕎（10.10 mg GAE·g-1 DW），占總酚含量的90%以上，但川蕎1號中結合酚的含量（2.08 mg GAE·g-1 DW）低于九江苦蕎（2.61 mg GAE·g-1 DW）;由圖1：B可知，川蕎1號提取物中游離黃酮含量為30.66 mg RE·g-1 DW，約占總黃酮含量的97%，且顯著高于九江苦蕎游離黃酮的含量（13.36 mg RE·g-1 DW），而結合黃酮的含量僅為0.81 mg RE·g-1 DW，低于九江苦蕎結合黃酮的含量（1.32 mg RE·g-1 DW），并且川蕎1號和九江苦蕎總酚和總黃酮含量存在顯著差異。表明苦蕎提取物中酚類物質主要以游離態的形式存在，且黑苦蕎川蕎1號具有更高的酚類物質含量。

2.3 酚類物質組成及含量

如圖2所示，在川蕎1號和九江苦蕎游離態和結合態提取物中共鑒別到6種黃酮物質，依次是槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷、表兒茶素、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚（峰1-峰6）。6種黃酮單體含量如表2所示，川蕎1號游離態提取物中6種單體含量均高于九江苦蕎。其中川蕎1號和九江苦蕎游離態提取物中蘆丁的含量（分別為16.78和6.47 mg·g-1 ）顯著高于其他物質，分別占游離態黃酮含量的54.74%和48.41%;其次為槲皮素（分別為3.04和0.61 mg·g-1），分別占游離黃酮含量的9.92%和4.60%。結合態提取物中以表兒茶素和蘆丁為主，其中川蕎1號和九江苦蕎中蘆丁的含量（0.28 和0.48 mg·g-1）分別占結合黃酮含量的34.29%和36.62%，其次是山奈酚-3-蕓香糖苷和槲皮素。川蕎1號結合酚中山奈酚的含量最低，但是在九江苦蕎結合酚中并未檢測到山奈酚。

2.4 抗氧化性分析

如表3所示，川蕎1號游離態提取物的DPPH、ABTS和FRAP三種抗氧化能力值分別為30.14、11.03、18.84 mg TE·g-1 DW，其抗氧化能力均占總抗氧化活性的86.00%以上，高于九江苦蕎的三種抗氧化能力值。結合態提取物雖具有一定的抗氧化活性，但其在總抗氧化活性的占比較小，且川蕎1號結合態提取物抗氧化能力低于九江苦蕎。

2.5 相關性分析

川蕎1號提取物中酚類、黃酮和抗氧化能力（DPPH、ABTS、FRAP）之間的相關性分析結果見表4。多酚和黃酮與DPPH、ABTS和FRAP均顯著相關，R值大于0.9（P<0.01）。并且三種抗氧化能力之間顯著相關，R值在0.867～0.965之間。

3討論

3.1 低海拔地區黑苦蕎籽粒的多酚組成和分布

多酚類物質作為一類重要的抗氧化成分，普遍分布在蔬菜、水果和谷物中。本研究表明，低海拔地區種植的川蕎1號黑苦蕎籽粒中總酚（27.38 mg GAE·g-1 DW）和總黃酮（31.46 mg RE·g-1 DW）的含量顯著高于九江苦蕎（12.71 mg GAE·g-1 DW和14.68 mg RE·g-1 DW），推測可能與苦蕎籽粒的形狀和大小等有關（劉琴等，2014），并且本試驗提取物中總黃酮含量顯著高于陜西苦蕎（7.23 mg RE·g-1 DW）（Liu et al.， 2018）。游離酚和游離黃酮占總酚和總黃酮含量的79%以上，說明苦蕎籽粒中酚類物質主要以游離態的形式存在，這與Adom & Liu（2002）報道的玉米、小麥、大米等其他谷物酚類物質主要以結合態形式存在的結果相反，而與Guo et al.（2012）報道的苦蕎酚類物質存在形式的結果基本一致。另外，川蕎1號提取物中結合酚的含量（2.08 mg GAE·g-1 DW）低于九江苦蕎 （2.61 mg GAE·g-1 DW）。相比于前人研究的四川涼山苦蕎（0.096～0.308 mg GAE·g-1 DW）（李海萍，2010）、大豆（0.14～0.78 mg GAE·g-1 DW）（Wang et al.， 2016）和大米（0.38～1.08 mg GAE·g-1? DW）（Pang et al.，2018）中結合酚的含量，川蕎1號和九江苦蕎具有更高的應用價值，推測可能是多酚合成相關基因、地區生長環境、所選品種和提取溶劑等因素的差異導致（Xu & Chang， 2007; Guo et al.， 2011;張敏等，2018），這需要進一步深入研究。

通過HPLC初步確定苦蕎籽粒中的酚類物質主要由黃酮類化合物構成，其中川蕎1號中蘆丁的含量高達17.06 mg·g-1，占總黃酮含量的50%以上，顯著高于九江苦蕎（6.47 mg·g-1）和四川苦蕎（7.62～13.37 mg·g-1）（Peng et al.， 2017）。Li et al.（2010）和周曉婷（2017）報道苦蕎中游離酚主要是蘆丁和槲皮素，與本研究結果基本一致。而Guo et al.（2011）報道的關于苦蕎結合酚主要是蘆丁和兒茶素，與本研究結合態酚類物質主要是蘆丁和表兒茶素的結果不一致，這可能是蕎麥生長環境和所選擇的蕎麥品種等差異導致，這需要進一步深入研究。

3.2 黑苦蕎籽粒的抗氧化活性

前人研究結果表明苦蕎籽粒的抗氧化能力與多酚和黃酮含量成正相關 （劉琴等， 2014）。本研究發現川蕎1號黑苦蕎籽粒提取物的總抗氧化性顯著高于九江苦蕎的抗氧化性，其中DPPH和ABTS值高于Zhou et al.（2015）報道的陜西苦蕎的抗氧化性，主要是因為川蕎1號具有更高的多酚和黃酮含量，且多酚和黃酮含量與抗氧化性之間的相關系數均在0.92以上。提取物中游離態物質在DPPH、ABTS和FRAP的抗氧化能力占總抗氧化能力的72%以上，而結合態物質的抗氧化能力較低，說明苦蕎籽粒提取物的抗氧化活性主要來源于游離態活性物質。因此，低海拔地區的黑苦蕎籽粒富含多酚類化合物和較強的抗氧化活性，是優質苦蕎生產和加工的優質原料基地。

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（責任編輯 何永艷）