蟬花真菌液體發酵及活性成分測定

黃小忠　謝春芹　張雪松　凡軍民　許俊齊　陳松玲

摘要：利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）菌株進行液體發酵，并進行單因素和正交試驗，以實現蟬花真菌液態發酵條件包括pH值、溫度、搖床轉速、培養基裝液量的優化。結果表明，蟬花液體發酵的最優條件為pH值7.4、搖床轉速 150 r/min、溫度28 ℃、裝液量40%;在此條件下，測得的真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為95.82 mg/g，真菌多糖、蟲草酸含量皆高于天然蟬花。

關鍵詞：蟬花;液體發酵;活性成分;測定

中圖分類號： S567.3+50.1;S188+.4

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0197-04

收稿日期：2018-10-29

作者簡介：黃小忠（1981—），男，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事發酵工程研究。E-mail：huangxiaozhong@jsafc.edu.cn。

通信作者：謝春芹，副教授，主要從事食藥用菌研究。E-mail：xiechunqin@jsafc.edu.cn。

蟬花（Cordyceps cicadae），別稱大蟲草，屬蟲生真菌，與冬蟲夏草有非常接近的親緣關系，屬麥角菌科（Clavicipttaceus）蟲草屬（Cordyceps），在我國，蟬花主要分布在四川省、江蘇省、浙江省、福建省等地[1]。

國內外多項研究成果表明，蟬花具有多種保健作用，包括提高人體自身免疫力、抗疲勞、養腎、養肝、改善睡眠、抗腫瘤、抗輻射和明目等，是一味具有神奇效果的古老中草藥[2]。李時珍在《本草綱目》中記載的藥效為：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。蟬花的天然成分與冬蟲夏草類似，具有相同的藥用價值，且尚未檢測出有毒重金屬如碘、汞、鉛等，在安全性方面蟬花顯然優于冬蟲夏草，同時蟬花的價格相對于冬蟲夏草而言較低，因此蟬花常作為冬蟲夏草的替代品。

蟬花對生長條件要求比較嚴格，需要特定的生態環境和寄主昆蟲（金蟬）[3]，這是蟬花資源稀少的主要原因。近幾年隨著生態環境的破壞，蟬花的生長區域大范圍縮小;同時人們開始認識到蟬花的價值，使蟬花遭到了瘋狂的采摘，導致蟬花資源迅速減少。本試驗的目的是利用蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae），在經優化的液態培養條件下生產蟬花菌絲體，并對菌絲體的生物活性物質進行提取及測定分析，以期通過菌絲體發酵來獲得天然蟬花含有的藥用活性物質，為規模化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌種來源

蟬花（Cordyceps cicadae）菌株來自江蘇省食用菌研究所。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 甘露醇標準品、乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、孟加拉紅染色劑、氯霉素、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、高碘酸鉀、苯酚、濃硫酸、無水乙醇。

1.2.2 儀器 水浴恒溫振蕩器;電子天平;立式壓力蒸汽滅菌器;數顯恒溫水浴鍋;可見分光光度計;冷凍真空干燥機。

1.3 培養基

1.3.1 菌種保藏培養基 PDA斜面試管培養基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 L，pH值自然，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.3.2 種子培養基 土豆200 g、蔗糖50 g、豆粕 5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，pH值自然，在 121 ℃ 下滅菌30 min備用。

1.3.3 發酵培養基 蔗糖40 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 1.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，加水至1 L，在121 ℃下滅菌30 min備用。

1.4 發酵種子的制備

1.4.1 菌種活化 將試驗分離所得到的在低溫保藏的蟬花菌種通過無菌操作接種于PDA平板培養基上，在溫度為 28 ℃ 條件下培養2～3 d進行活化，當菌絲長滿整個培養皿時，即可使用[4]。

1.4.2 孢子懸浮液的制備 在無菌條件下，用接種鉤從培養基上取大小約0.3 cm×0.3 cm的母種塊，接種于盛有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中（菌塊稍帶培養基且要薄，以能浮在培養液表面為最佳），在溫度為28 ℃，轉速為180 r/min的恒溫搖床中培養72 h[5]。

1.5 液體發酵條件的確定

1.5.1 發酵溫度的優化 取5 mL菌懸液，接入裝液（發酵培養基）量為40%的250 mL三角瓶中，將恒溫搖床的溫度分別設為22、25、28、31、34 ℃，搖床轉速設為150 r/min，培養5 d后測其生物量。

1.5.2 發酵pH值的優化 取5 mL菌懸液，接入初始pH值分別為6.5、6.8、7.1、7.4，培養基裝液量為40%的250 mL三角瓶中，置于溫度為28 ℃的搖床中以轉速為150 r/min的速率進行培養，培養5 d后測其生物量。

1.5.3 發酵搖床轉速的優化 取5 mL菌懸液，接入裝液量為三角瓶中，將搖床的轉速分別設為110、130、150、170、190 r/min，在溫度為28 ℃條件下恒溫培養5 d后測其生物量。

1.5.4 發酵裝液量的優化 在裝液量分別為20%、40%、60%、80%的三角瓶中接入5 mL菌懸液，置于溫度為28 ℃的恒溫搖床中以轉速為150 r/min的速度培養5 d后測其生物量。

1.5.5 正交試驗的確定 選擇溫度、搖床轉速、pH值和裝液量為試驗因素，進行4個因素3個水平 L9（34） 正交試驗設計，對發酵結果進行極差和方差分析，探討各種培養條件對蟬花液態發酵所獲得的生物量和蟲草酸含量的影響程度。

1.6 測定方法

1.6.1 生物量測定方法 采用細胞干質量法[6]測定蟬在液態發酵所獲生物量，具體操作為在發酵液培養完成后，用100目篩過濾得到菌絲體和胞外液，用蒸餾水反復沖洗菌絲體直至所出濾液澄清為止，將所收集的菌絲體置于玻璃紙上，放入烘箱中，在溫度為60 ℃條件下烘干至恒質量，稱質量得生物量。

1.6.2 蟲草酸含量測定 通過微波提取法[7]提取菌絲體中的蟲草酸。利用高碘酸鈉比色法[8]測定蟲草酸含量。

1.6.2.1 微波提取法 取0.05 g干燥液體發酵菌絲體加入10 mL蒸餾水中在微波爐中通過中火加熱2 min進行微波處理。處理完畢后在3 000 r/min下離心25 min，取上清液加入到50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容。

1.6.2.2 高碘酸鈉比色法 取50 mg甘露醇加入到50 mL蒸餾水中配置成1 mg/mL甘露醇溶液，分別取1、2、3、4、5 mL甘露醇溶液于100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，得到10、20、30、40、50 μg/mL樣液，取樣液各1 mL，加1 mL高錳酸鉀溶液（加0.15 mol高錳酸鉀于100 mL 0.12 mol/L鹽酸溶液中混勻）。室溫放置10 min，加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液除去過多的高碘酸鹽。混合后加4 mL新配NaSH試劑（150 g乙酸銨，2 mL冰乙酸，2 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋至 1 000 mL），53 ℃水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，用蒸餾水代替甘露醇標準液。在波長為412 nm處測吸光度（D412 nm），將測得的吸光度通過回歸方程進行計算，然后通過下式計算菌絲體中蟲草酸的含量[8]。

R=C×V×101 000×m。

式中：R為菌絲體中蟲草酸含量，mg/g;C為提取液中蟲草酸含量，μg/g;10為試樣浸提后定容體積，mL;V為提取液體積，mL;m為試樣的準確質量，g。

1.6.3 真菌多糖含量的測定 將干燥后的菌絲體進行前處理。步驟：熱水提取、乙醇沉淀、脫色、去蛋白、低溫干燥。采用硫酸-苯酚法[9]測定真菌多糖含量。

1.6.3.1 前處理 取2 g干燥液體發酵菌絲研磨成粉末，用水提醇法提取，即加10倍量的蒸餾水，100 ℃水浴煎煮 1 h，重復3次，過濾提取液，濃縮至1 g ∶1 mL，加3倍量的95%乙醇進行沉淀，5 000 r/min 離心5 min，取上清液，繼續加95%乙醇放置，傾出上清液，沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇洗滌、過濾，低溫干燥24 h，即得多糖粗品。

1.6.3.2 硫酸-苯酚法測定真菌多糖 將提取的多糖樣品置于10 mL容量瓶中，加雙蒸水溶解，并稀釋到刻度線位置，搖勻，備用。標準曲線的制作：吸取葡萄糖標準液（100 μg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別加入到各試管中，用雙蒸水補足至每管2 mL，使各管葡萄糖含量分別為0、10、20、30、40、60、80、100 μg。向各管中分別加入0.05 mL 80%苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸（勿沿管壁加入，以便使樣品與硫酸快速混勻），靜置10 min，30 ℃ 水浴15 min。在490 nm波長處測各管的吸光度，以糖濃度為橫坐標，各管的吸光度為縱坐標作標準曲線，作回歸方程曲線，通過以下公式計算真菌多糖含量。

R′=C′×V′1 000×ω。

式中：R′為菌絲體中真菌多糖含量，mg/g;C′為提取液中真菌多糖含量，μg/g;V′為提取液體積，mL;ω為干菌絲體質量，g。

2 結果與分析

2.1 蟬花生物量的獲得

2.1.1 發酵溫度對生物量的影響 蟬花真菌在不同溫度下進行液態發酵培養的結果見圖1。對于微生物液態發酵培養來說，溫度的影響是雙方面的：隨著溫度升高，可以加速微生物的生長代謝，但是溫度過高不僅會導致微生物體內的酶失活還容易使菌體老化，從而影響微生物的正常生長以及代謝產物的積累;溫度過低則導致菌體生長緩慢，因而積累的代謝產物較少。蟬花真菌菌株在溫度為 22～34 ℃ 條件下均能生長，在溫度為28 ℃條件下所獲得的生物量最大，為5.63 g/L。

2.1.2 發酵pH值對生物量的影響 不同pH值對生物量的影響見圖2。在正常條件下，pH值過低菌體容易衰老，而pH值過高則會導致菌體自溶。本試驗通過設置不同的pH值來考察蟬花液體發酵培養的最佳pH值。蟬花真菌在pH值為 6.5～7.7條件下均能生長，生物量隨著pH值的上升出現了先增加后減少的現象，在pH值為7.1時所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.3 發酵搖床轉速對生物量的影響 蟬花真菌屬于好氧微生物，菌絲的生長需要消耗氧氣，提高搖床的轉速，不僅可以增大液體接觸空氣的面積，還對蟬花真菌的生長有促進作用;轉速太小影響通氣量，從而影響溶氧量，不利于菌絲生長;搖床轉速超過最佳轉速時，由于剪切力增加，菌絲被切斷導致菌絲體難以成形，因此難以維持正常的生長，導致獲得的生物量減少（圖3）。在搖床轉速為 150 r/min 時所獲生物量最大，為4.68 g/L。

2.1.4 發酵裝液量對生物量的影響 不同裝液量對生物量的影響結果見圖4。裝液量主要影響發酵過程中的通氣情況，從而影響菌絲體的生長，裝液量過小導致培養基水分蒸發較快，代謝物濃度較大，溶氧量下降;裝液量過大會使振蕩效果減弱，溶氧量降低。蟬花真菌液態發酵最佳裝液量為40%，此時生物量為5.37 g/L。

2.2 蟬花真菌最佳液態發酵培養條件

選擇溫度、裝液量、搖床轉速、pH值為試驗因素，因素水平表見表1。

正交試驗優化結果見表2，影響蟬花真菌液態發酵生物量的各因素主次為A>C>D>B，即溫度對蟬花真菌液態發酵過程中生物量的影響最大，搖床轉速次之，pH值再次之，裝液量對生物量的影響最小。根據表2直觀分析最佳發酵條件為A2B1C2D3， 該條件下發酵液中的生物量為6.13 g/L。

蟬花真菌液體發酵培養的最佳條件：溫度為28 ℃，搖床轉速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

2.3 蟬花菌絲體中的活性成分測定

2.3.1 蟲草酸含量標準曲線的制備 根據高碘酸鈉比色法，作蟲草酸（D-甘露醇）含量的標準曲線（圖5）。蟲草酸含量的回歸方程：y=0.004 0x+0.003 2。根據“1.6.2”節中的方法得到的樣品吸光度為 0.572，蟲草酸含量為95.82 mg/g。

2.3.2 蟬花真菌多糖含量標準曲線的制備 根據硫酸-苯酚法，作真菌多糖標準曲線（圖6）。真菌多糖含量的回歸方程：y=0.067 5x-0.014 0。根據“1.6.3”節中的方法得到的樣品吸光度是0.497，真菌多糖含量為107.45 mg/g。

3 結論與討論

本研究通過對蟬花真菌進行液體發酵工藝優化試驗發現，蟬花真菌液體發酵培養的最佳條件是溫度為28 ℃，搖床轉速為150 r/min，pH值為7.4，裝液量為40%。

文欣等發現，在改良的液體發酵條件下得到的蟬花菌絲生物量為 5.72 g/L，真菌多糖含量為86.71 mg/g，蟲草酸含量為 90.13 mg/g[10]。黃小忠等在改良的液體發酵培養基條件下，得到的蟬花菌絲生物量為5.63 g/L，真菌多糖含量為88.73 mg/g，蟲草酸含量為82.58 mg/g[2]。本研究在使用改良液體發酵培養基的基礎上，優化了發酵工藝，所獲得的生物量為 6.13 g/L，真菌多糖含量為107.45 mg/g，蟲草酸含量為 95.82 mg/g。3項指標皆明顯提高，在發酵中所獲得的蟬花菌絲體活性物質與天然蟬花中活性物質相同，但蟬花菌絲體中的天然有益物質真菌多糖和蟲草酸的含量均高于天然蟬花，天然蟬花真菌多糖含量為33.2 mg/g，蟲草酸含量為53.6 mg/g[11]。因此將蟬花液體發酵菌絲體用于保健用品開發，以替代天然蟬花的使用不無可能，此方法不僅可以降低生產成本，也可減少對天然蟬花資源的破壞。

本研究對蟬花液體發酵條件進行了考察，優化了蟬花液體發酵工藝條件。后續還將會對蟬擬青霉菌種進行選育考察，同時將繼續研究和改良發酵培養基的配方，在打破傳統配方的基礎上，尋找更適合蟬花發酵的碳源、氮源等材料，從而進一步優化蟬花發酵工藝。

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