食品大腸菌群間接計數法在水質大腸菌群監測中的應用效果

趙衛紅　徐秋琴　裴擁軍　毛云斌　黃曾　鄒錦群　詹卓蓬

[摘要]目的 探討GB 4789.3-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中的間接計數法（MPN法）檢測水質大腸菌群的效果。方法 采集2017年10月～2018年4月豐城市城市生活飲用水、農村生活飲用水、水庫水、水源水等各類水質，利用GB 4789.3-2016中的MPN法與GB/T 5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》中的總大腸菌群MPN法檢測水質大腸菌群，驗證兩種方法檢測水質大腸菌群的關聯性，比較分析兩種方法檢測每項陽性樣本所花費的人力、物力、費用、時間以及大腸菌群陽性率。結果 兩種MPN法檢測水質大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97）;兩種MPN法檢測水質大腸菌群的陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費、試劑費用、消耗人力費用均低于水質大腸菌群MPN法，消耗時間短于水質大腸菌群MPN法，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 食品大腸菌群MPN法可替代水質大腸菌群MPN法用于水質大腸菌群的檢測，可大大節省人力、物力、財力。

[關鍵詞] GB 4789.3-2016間接計數法;GB/T 5750.12-2006間接計數法;人力消耗;物力消耗;時間消耗

[中圖分類號] R123.1 ? ? [文獻標識碼] A ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）3（b）-0159-04

Application effect of food coliform indirect counting method in water quality coliform monitoring

ZHAO Wei-hong? ?XU Qiu-qin? ?PEI Yong-jun? ?MAO Yun-bin? ?HUANG Zeng? ZOU Jin-qun? ?ZHAN Zhuo-peng

Department of Clinical Laboratory， Fengcheng Center for Disease Control and Prevention in Jiangxi Province， Fengcheng? ?331100， China

[Abstract] Objective To explore the effect of indirect counting method （MPN method） in GB 4789.3-2016 "National Food Safety Standard for food microbiology test—Coliforms Count" on detecting coliforms in water. Methods The water samples were inciuded urban drinking water， rural drinking water， reservoir water， and water source from Fengcheng city from October 2017 to April 2018. The coliforms in water were detected by the MPN method in GB 4789.3-2016 and the total coliforms MPN method in GB/T 5750.12-2006 "Standard examination methods for drinking water—Microbilolgical parameters"， separately. The correlation between the two methods for detecting coliform bacteria was verified. The manpower， material resources， cost， time and the positive rate of coliform bacteria detected by the two methods were compared. Results The consistency of two MPN methods to detect coliform group in water quality was good （Kappa=0.97）. There was no significant difference in the positive rate of coliform detected by two MPN methods （P>0.05）. The instrument cost， reagent cost and labor cost of food coliform group MPN method were lower than those of water coliform group MPN method， and the consumption time was shorter than that of water coliform group MPN method， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion MPN method of food coliform group can replace MPN method of water coliform group to detect coliform group of water quality， which can greatly save manpower， material and financial resources.

[Key words] GB 4789.3-2016 indirect counting method; GB/T 5750.12-2006 indirect counting method; Labor consumption; Material consumption; Time consumption

大腸菌群為水質衛生監測的指示菌[1]，實現其快速檢測具有重要的衛生學意義。目前，對于大腸菌群快速檢測的方法大部分是基于對其核酸的分子生物學檢測，這些技術對實驗條件的要求高，價格昂貴，因此限制了其應用[2]。目前普遍采用的水質大腸菌群間接計數法（MPN法）較食品大腸菌群MPN法操作步驟多，繁雜，且工作量較大[3]。本研究將食品大腸菌群MPN法用于水質大腸菌群的檢測，驗證實試驗驗證大腸菌群的檢測效果，對照水質大腸菌群MPN法的檢測時間、消耗的人力、物力以及大腸菌群檢出率，旨在探討食品大腸菌群MPN法用于水質大腸菌群檢測的應用價值，現報道如下。

1材料與方法

1.1樣本與試劑

采集2017年10月～2018年4月豐城市城市生活飲用水、農村生活飲用水、水庫水、水源水等各類水質，試劑包括：乳糖蛋白胨培養液、革蘭染色液、伊紅美藍瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯（青島高科技園海博生物技術有限公司）。

1.2儀器與設備

YC-180澳柯瑪冰箱（澳柯瑪股份有限公司）、 JM-A電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）、CJV1500T潔凈工作臺（山東新華醫療器械廠）、LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫療器械廠）、5V電動移液槍（DLAB Scientific Inc）。

1.3方法

1.3.1檢測前準備? 高壓滅菌消毒采水容器，將水樣本置入容器中，在6 h內送到檢測實驗室。

1.3.2水質大腸菌群檢測方法? 采用GB/T5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》中的總大腸菌群MPN法。用滅菌吸管取10 ml水樣接種到10 ml雙料乳糖蛋白胨培養液中，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1 ml水樣加到9 ml生理鹽水中混勻，用1 ml滅菌吸管注入到10 ml單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管，總共15管。

將接種管置于（36±1）℃培養箱內，培養（24±2）h，如有產酸、產氣管，分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，于（36±1）℃培養箱內培養18～24 h，符合深紫黑色，有金屬光澤;紫黑色帶或略帶金屬光澤;淡紫紅色，中心較深的菌落，做革蘭染色、鏡檢、證實實驗。計大腸菌群陽性管數，查MPN表得出大腸菌群最可能數（MPN）值。

1.3.3食品大腸菌群檢測方法? 采用GB 4789.3-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗? 大腸菌群計數》中的MPN法檢測。用滅菌吸管取10 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養液中，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養液中，另取1 ml水樣加到9 ml生理鹽水中混勻，用滅菌吸管取1 ml水樣接種到10 ml LST肉湯管培養液中，每一稀釋度接種3管，總共9管。

將接種管置于（36±1）℃培養箱內，培養24～48 h，產氣管進行復發酵試驗，取培養物1環，移種于BGLB肉湯管中，（36±1）℃培養（48±12） h，計大腸菌群陽性管數，查MPN表得出大腸菌群MPN值。

1.3.4兩種方法的一致性檢驗? 采用統計學Kappa檢驗驗證GB 4789.3-2016中的MPN法與GB/T 5750.12-2006中的總大腸菌群MPN法檢測水質中大腸菌群的一致性，證明兩種方法均能用于水質中大腸菌群的檢測。

1.4觀察指標

比較兩種方法檢測每項陽性樣本所花費的人力、物力、費用、時間，評價兩種方法大腸菌群的檢測效果，并分析兩種方法檢測的大腸菌群陽性率。

1.5統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義;采用Kappa值檢驗一致性，Kappa≥0.75提示一致性較好。

2.結果

2.1兩種MPN法檢測水質大腸菌群的一致性

兩種MPN法檢測水質大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97）（表1）。

2.2兩種MPN法檢測水質大腸菌群陽性率的比較

兩種MPN法檢測水質大腸菌群的陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

2.3兩種MPN法所耗成本的比較

食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費、試劑費用、消耗人力費用均低于水質大腸菌群MPN法，消耗時間短于水質大腸菌群MPN法，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

3討論

大腸菌群是公認的水質衛生監測指示菌[4-5]，便利、快速、廉價的檢測方法對確保水質的衛生至關重要。目前國內外對于大腸菌群快速檢測方法很多，這些方法包括核酸雜交技術、聚合酶鏈式反應（PCR）及其衍生技術、基于16SrRNA與GyaB的檢測技術[1]、化二硫化鉬（MoS2）納米片的光纖表面等離子體共振免疫傳感器快速檢測技術[6]、流式細胞阻抗儀檢測[7]、組合的單砷化丙啶染色和定量PCR檢測[8]、智能手機的凝膠環介導的等溫擴（gLAMP）系統[9]、人類致病菌下一代測序[10]、氯酚的生物降解[11]、生物物傳感器蛋白子彈快速檢測飲用水中大腸桿菌的熒光方法[12]、快速檢測體細胞噬菌體的方法（Bluephage法）[13]、濃縮和免疫檢測法[14]等，這些方法快捷、精確，但需要高精儀器與設備，費用也非常昂貴，不適宜在基層疾控中心應用。

一般水質大腸菌群檢測，常規采用國標GB/T 5750.12-2006中的MPN檢測方法，但此法耗費的人力、物力很高、時間較長。本研究采用食品國標GB 4789.3-2016中的MPN檢測方法，用于檢測水質的大腸菌群，經過兩種方法檢測大腸菌群的關聯性檢驗，結果顯示，兩種MPN法檢測水質大腸菌群的一致性較好（Kappa=0.97），提示兩種方法均能用于大腸菌群的檢測，且通過兩種方法大腸菌群的檢出率對比分析，結果顯示，兩種MPN法檢測水質大腸菌群的陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。提示食品大腸菌群MPN法用于水質大腸菌群的檢測有一定的可行性。本研究結果還顯示，食品大腸菌群MPN法的儀器耗損費、試劑費用、消耗人力費用均低于水質大腸菌群MPN法，消耗時間短于水質大腸菌群MPN法，差異有統計學意義（P<0.05），提示食品大腸菌群MPN法具有較好的經濟及時間效益[15]。

綜上所述，兩種方法檢出的大腸菌群陽性率基本一致，而GB/T 5750.12-2006中的MPN檢測方法需要比食品GB 4789.3-2016中的MPN檢測方法更多的人力、物力、財力，且操作繁瑣，花費的時間較長。因此，基層疾控單位采用食品GB 4789.3-2016中的MPN法替代GB/T 5750.12-2006中的MPN法檢測水質中的大腸菌群，可以因地制宜、操作方便、節省開支與時間。

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（收稿日期：2019-07-23? 本文編輯：閆? 佩）