NGF-BMSCs移植對AD動物模型癥狀改善及對腦組織中凋亡相關基因Bcl-2、Bax水平的影響

梁金　谷新醫　蔣志宏　馬強

[摘要]目的 探討神經生長因子-骨髓基質干細胞（NGF-BMSCs）移植對阿爾茲海默病（AD）動物模型癥狀改善及對腦組織中凋亡相關基因B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bax水平的影響。方法 將50只AD大鼠隨機分為5組，分別為對照組、鹽水注射組、模型組、BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組，每組各10只。觀察AD大鼠的行為學變化情況，檢測大鼠海馬區Bcl-2、Bax水平。結果 模型組和鹽水注射組第1～6天的逃避潛伏期均短于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs移植組、NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期均長于對照組、模型組和鹽水注射組，差異有統計學意義（P<0.05）;NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期長于BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、鹽水注射組、BMSCs移植組、NGF-BMSCs移植組的Bcl-2、Bax水平均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;鹽水注射組和BMSCs移植組的Bcl-2水平均高于模型組，Bax水平均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組的Bcl-2均低于鹽水注射組，差異有統計學意義（P<0.05）;NGF-BMSCs移植組的Bcl-2水平低于BMSCs移植組，Bax水平高于鹽水注射組、BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 NGF-BMSCs移植通過調節AD動物模型海馬組織中Bcl-2、Bax表達水平抑制其神經細胞凋亡。

[關鍵詞]神經生長因子基因-骨髓基質干細胞移植;阿爾茲海默病;動物模型;癥狀改善;凋亡基因

[中圖分類號] R743? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）3（b）-0004-04

Effect of NGF-BMSCs transplantation on the improvement of symptoms in AD animal model and the levels of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax in brain tissue

LIANG Jin? ?GU Xin-yi? ?JIANG Zhi-hong? ?MA Qiang

The Second Department of Neurology， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian? ?116000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nerve growth factor-bone marrow stromal stem cells （NGF-BMSCs） transplantation on the improvement of symptoms in （AD） animal model and the levels of apoptosis-related genes B lymphocyte tumor-2 （Bcl-2） and Bax in brain tissue. Methods Fifty AD rats were randomly divided into five groups， namely the control group， saline injection group， model group， BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group， with 10 rats in each group. The behavioral changes of AD rats were observed， and the levels of Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats were detected. Results The escape latency of the model group and the saline injection group from the first day to the sixth day was shorter than that of the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. The escape latency of BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group from the first day to the sixth day was longer than that of the control group， model group and saline injection group， with statistically significant differences （P<0.05）. The escape latency of the NGF-BMSCs transplantation group from the first day to the sixth day was longer than that of the BMSCs transplantation group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The levels of Bcl-2 and Bax in the model group， saline injection group， BMSCs transplantation group， and NGF-BMSCs transplantation group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The Bcl-2 levels in the saline injection group and the BMSCs transplantation group were higher than those in the model group， the Bax levels were lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of Bcl-2 in the BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group were lower than those in the saline injection group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The Bcl-2 level in the NGF-BMSCs transplantation group was lower than that in the BMSCs transplantation group， the Bax level was higher than that in the saline injection group and in the BMSCs transplantation group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion NGF-BMSCs transplantation can inhibit neuronal apoptosis in AD animal models by regulating the expression levels of Bcl-2 and Bax in hippocampus.

[Key words] Nerve growth factor-bone marrow stromal stem cells transplantation; Alzheimer′s disease; Animal model; Symptom improvement; Apoptotic gene

阿爾茲海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種常見的原發性中樞神經系統退行性疾病，由于我國人口老齡化現象的加劇，AD的發病率呈逐年上升的趨勢，老年人為該病的高發人群，該病發病較隱匿，并呈緩慢進行性加重，臨床表現主要包括認知功能障礙、行為異常和生活能力降低等[1]。AD的發病機制為腦部組織中海馬區神經元受損，進而形成進行性的記憶減退病變。AD發病和海馬神經元凋亡引發的神經損傷具有一定的關系。克隆的神經生長因子（nerve growth factor，NGF）能夠延緩成年嚙齒類動物的神經元退行性變[2]。相關研究表明，氧化應激是AD疾病發生發展的主要原因，而B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bax水平的高低對神經細胞凋亡、分化再生、代謝及修復等有重要的影響[3]。鑒于此，本研究旨在探討NGF-骨髓基質干細胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）移植對AD動物模型癥狀改善及對腦組織中凋亡相關基因Bcl-2、Bax水平的影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

50只成年健康SD大鼠，體重280～320 g，平均（300±50）g;均為雄鼠，由昆明醫學院動物科提供，合格證號SXCK（皖）2011-002，適應性飼養7 d后用于實驗。本實驗符合動物實驗倫理。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1儀器? 微型鉆（東莞能者機電科技有限公司）、水浴鍋（鞏義市予華以期有限公司）、離心機（張家港市卓航機械有限公司）、通風柜（廣州祿米實驗室設備科技有限公司）、低速離心機（上海趙迪生物科技有限公司）、-80℃冰箱（邢臺潤聯科技發展有限公司）。

1.2.2試劑? 3.6%的水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，國藥準字 H37022673）、β淀粉樣蛋白（上海誠凜生物科技有限公司，粵械注準 20152400854）、3%的雙氧水（南昌白云藥業有限公司，國藥準字 H36021594）、羊血清封閉液（北京索萊寶科技有限公司，國藥準字 H200937495）、二氨基聯苯胺（成都嘉葉生物科技有限公司，生產批號：20180303）、70%的酒精、80%的酒精、90%的酒精、95%的酒精、100%的酒精、二甲苯[上海瑞齊生物技術有限公司，生產批號：滬食藥監械（準）字2013第1401615號]、液氮（新鄉市鑫鴻低溫容器制造有限公司）。

1.3實驗分組及處理

1.3.1實驗分組? 50只成年健康SD大鼠隨機分為5組，分別為對照組、鹽水注射組、模型組、BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組，每組各10只。

1.3.2處理? 構建NGF-BMSCs重組體，移植到AD大鼠海馬區。制備AD大鼠模型：將3.6%的水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔注射至大鼠體內，麻醉后先將大鼠頭皮切開，于前囟旁開2.0 mm，后開3.0 mm，向下3.0作為坐標，使用微型鉆將顱骨鉆開后進針，將10 μl的β淀粉樣蛋白1-40（amyloid β，Aβ 1-40）注射到大鼠的雙側海馬內。

對照組：大鼠未注射Aβ蛋白;鹽水注射組：每只大鼠肌肉注射生理鹽水2 ml;模型組：大鼠不做任何處理，正常飼養;BMSCs移植組：造模后7 d，選取雙側海馬作為移植區，注射BMSCs細胞懸液;NGF-BMSCs移植組：造模后7 d，注射NGF-BMSCs細胞懸液。待大鼠完成移植術后的15 d，取待檢樣品進行水迷宮實驗。

1.4觀察指標

比較對照組、模型組、鹽水注射組、BMSCs移植組、NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期（在水中找到平臺并爬上平臺的時間，以此判斷其行為能力）和凋亡相關基因水平，凋亡相關基因包括Bcl-2、Bax。

利用免疫組織化學染色法對大鼠海馬組織中的凋亡基因Bax和Bcl-2水平進行檢測。大鼠斷頭后取腦，將海馬組織分離，放置在液氮中進行保存。將裂解液和蛋白磷酸酶抑制劑的混合物加入到大鼠的海馬組織中，通過超聲勻漿器將組織破碎后進行離心，取上清液為待檢樣品，以二步法進行測定。將3%的雙氧水中置于37℃水浴鍋進行孵育，時間為30 min;再加入5%的羊血清封閉液，孵育30 min;以Bax（1∶300）、Bcl-2（1∶400）的比例加入I抗體，置于4℃冰箱內過夜;再加入Ⅱ抗體，于37℃水浴鍋進行孵育，時間為30 min。加入二氨基聯苯胺進行顯色處理，再行裱片和脫水：用水沖洗顯色后的片子，分別將載玻片放到70%的酒精-80%的酒精-90%的酒精-95%的酒精-100%的酒精-100%的酒精-二甲苯-二甲苯，每個試劑中需放置2 min，于二甲苯中進行浸泡，搬至通風柜中。將中性樹膠滴在海馬組織旁，用蓋玻片蓋上后放平一側，再輕放下另一側，避免出現氣泡，將片子封好后放到通風柜中進行晾干。

1.5統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組內、組間兩兩比較采用SNK檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組逃避潛伏期的比較

各組同組內第1～6天的逃避潛伏期比較，差異有統計學意義（P<0.05）;模型組和鹽水注射組第1～6天的逃避潛伏期均短于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs移植組、NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期均長于對照組、模型組和鹽水注射組，差異有統計學意義（P<0.05）;NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期長于BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Bax水平的比較

模型組、鹽水注射組、BMSCs移植組、NGF-BMSCs移植組的Bcl-2、Bax水平均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;鹽水注射組和BMSCs移植組的Bcl-2水平均高于模型組，Bax水平均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組的Bcl-2水平均低于鹽水注射組，差異有統計學意義（P<0.05）;NGF-BMSCs移植組的Bcl-2水平低于BMSCs移植組，Bax水平高于鹽水注射組、BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

3.1 AD疾病的發病機制

AD是一種中樞神經性退行性疾病，臨床表現為記憶力能減退、認知功能發生障礙及日常生活能力下降等，該病與患者的年齡密切相關[4]。目前，臨床對于AD的發病機制尚未明確。研究顯示，NGF保護了由β淀粉蛋白誘發的大鼠腦損傷[5]。海馬區與學習記憶密切相關，廣泛的海馬神經元缺失是AD疾病的典型病理特征[6]。Bcl-2是一種具有抗凋亡作用的基因，而細胞凋亡是AD引發神經元喪失的重要原因[7-8]。Bax是一種促凋亡蛋白，其能夠使線粒體外膜的通透性發生改變，最終引發細胞出現內源性的凋亡[9-10]。相關研究發現，在AD腦退化患者的神經細胞中，Bcl-2的含量顯著降低，Bax的含量顯著升高[11]。

3.2 AD的治療機制

BMSCs是骨髓中除造血干細胞之外的另一種干細胞，BMSCs的作用是為造血干細胞構建造血系統微環境，并提供造血支持[12-13]。NGF表達上調及維持能夠明顯減輕AD患者的癡呆損害[14-15]。本研究對AD大鼠進行NGF-BMSCs移植，結果顯示，NGF-BMSCs移植組第1～6天的逃避潛伏期長于模型組、BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05）;NGF-BMSCs移植組的Bcl-2水平低于BMSCs移植組，Bax水平高于BMSCs移植組，差異有統計學意義（P<0.05），提示NGF-BMSCs移植可使AD動物模型Bcl-2水平降低，Bax水平升高，改善學習和記憶能力。

3.3 NGF-BMSCs移植對AD動物模型神經凋亡因子的作用機制

植入骨髓基質干細胞能夠對AD大鼠腦內細胞的神經凋亡起到抑制作用[16]。由于時間的推移，骨髓基質干細胞植入后使宿主腦內細胞發生變化，提高了抑制凋亡的效果[17]。骨髓基質干細胞能夠向神經元樣細胞進行分化，起到替代己壞死和凋亡的神經元的作用，并增加神經元數量[18];骨髓基質干細胞在腦組織中能夠分化神經元樣細胞及神經膠質樣細胞，替代壞死、凋亡的神經細胞，有效改善患者的腦功能[19]。NGF-BMSCs重組體移植能夠在患者前腦基底部發揮出減慢AD膽堿神經元退變的作用[20]。

綜上所述，NGF-BMSCs重組體移植通過調節AD動物模型海馬組織中Bcl-2、Bax表達水，顯著改善了AD大鼠的神經學行為，對AD治療研究提供了啟示。

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（收稿日期：2019-11-07? 本文編輯：任秀蘭）