前列腺素E2促進乙型肝炎病毒復制的機制研究

黃珊珊 趙靜雅 陳潔 楊揚

HBV會干擾宿主肝細胞的先天免疫反應和適應性免疫反應，進而導致持續感染以及肝損傷和炎癥[1-2]。通常慢性HBV感染的患者體內由細胞毒性T淋巴細胞(CTL)介導的病毒特異性T細胞殺傷反應較差甚至不存在，出現這種情況是由于T細胞在免疫應答反應中的‘疲勞’現象所致[3-4]。T細胞‘疲勞’的主要表征為增殖能力缺乏、效應細胞毒活性差、細胞因子產生受損、細胞凋亡增加以及多種抑制性受體持續表達[5-6]。但是阻斷抑制性受體途徑對于增加CTL數量及有效性的作用效果并不明顯[7]，因此需探究導致T細胞功能障礙的其他因素，為HBV感染患者提供有效的組合治療靶點。前列腺素類存在于幾乎所有的哺乳類細胞中，并且對多種刺激(如感染或者創傷)有反應，可作為脂質激素樣信號分子參與多種疾病的生理病理過程[8-9]。本研究以臨床樣本及實驗動物為研究對象，探究前列腺素類中的PGE2對HBV感染后病毒復制及CD8+T淋巴細胞功能的影響。

材料與方法

一、臨床血樣采集及檢測

選取西安大興醫院2018年1月至2018年12月慢性乙型肝炎(CHB)但未治療的患者120例和健康體檢者60名，收集血液樣本。CHB患者的診斷符合第七屆全國病毒性肝炎學術會議中制定的診斷標準，排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒和艾滋病病毒(或患有自身免疫性肝病)感染的患者。

血清中HBV DNA、ALT和AST檢測采用瑞士羅氏公司提供的試劑盒。

采用人前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒(上海EK-Bioscience公司)檢測血清中PGE2的濃度。采用ELISA試劑盒(瑞士Roche公司)檢測小鼠血清中HBsAg的濃度。

二、 動物實驗及分組

24只6～8周齡的C57BL/6小鼠購自西安交通大學[許可證號：SYXK(陜)2015-002]，體質量(28±2)g。重組病毒rAAV8-1.3HBV購自北京五加和分子醫學研究所有限公司，參照王剛等[10]建立的HBV感染小鼠模型。采用戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后，所有小鼠尾靜脈注射4×1010g/只rAAV8-1.3HBV，注射持續5～8 s。

然后將rAAV8-1.3HBV注射后的小鼠分為3組，對照組、PGE2組和PGE2受體拮抗組，每組各8只。PGE2組小鼠每2天注射1次PGE2的穩定類似物16,16-dimethyl PGE2(1 mg/kg，購自美國Sigma公司)，PGE2受體拮抗組小鼠每2天注射1次PGE2受體(EP2和EP4)拮抗劑AH6809和GW627368X(1 mg/kg，購自美國Cayman公司)，對照組注射DMSO，持續2周。

三、檢測方法

(一)流式細胞儀檢測CD8+T細胞功能相關指標 以密度梯度離心法從CHB患者的血樣及各組小鼠的肝臟組織中分離單核細胞。用流式細胞儀雙標記免疫熒光法測定患者血樣CD8+T淋巴細胞的占比，CD8+T淋巴細胞Tim3、顆粒酶B和穿孔素的表達，以及小鼠肝臟CD8+T淋巴細胞的占比，CD8+T淋巴細胞Tim3、TNF-α和IFNγ的表達。所有熒光標記單克隆抗體均購自美國Abcam公司。儀器采用美國BD Biosciences公司的BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀，BD FACS Diva 7.0軟件進行數據的統計分析。

(二)實時定量PCR檢測血清pgRNA的表達 采用Trizol試劑從各組小鼠血清中分離總RNA，采用實時定量PCR法分析各組小鼠血清中pgRNA的表達。采用SYBR Green Master試劑盒檢測pgRNA mRNA的表達。pgRNA的引物為：上游引物5′-CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT-3′，下游引物5′-AGGATAGAACCTAGCAGGCATAAT-3′。每個樣本重復3次，β-actin為內參。

三、統計學分析

結 果

一、CHB患者血清中PGE2與病毒復制和肝損傷的關系

CHB患者血清中PGE2水平(877.20±43.27)顯著高于健康體檢者(201.30±13.38)(t=14.92，P<0.05)。PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST水平顯著高于PGE2低水平患者，差異有統計學意義。見表1。

表1 各組患者血清HBV DNA、ALT和AST水平對比(±s)

二、CHB患者血清中PGE2與CD8+T淋巴細胞功能的關系

與PGE2低水平患者相比，PGE2高水平患者血樣CD8+T細胞Tim3的表達顯著增加(P<0.05)，顆粒酶B的表達顯著降低(P<0.05)。穿孔素的表達及CD8+T細胞的占比在兩組患者間差異無統計學意義。見表2。

表2 各組患者血樣中CD8+T淋巴細胞功能對比(%,±s)

三、PGE2促進HBV復制

與對照組相比，PGE2組小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平顯著增加(P<0.05)，PGE2受體拮抗組小鼠血清中HBV DNA及pgRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平對比(±s)

注：與對照組相比，*P<0.05

四、CD8+T淋巴細胞參與PGE2對HBV復制的調控

與對照組相比，PGE2組小鼠肝臟CD8+T淋巴細胞Tim3的表達顯著增加(P<0.05)，TNF-α和IFNγ的表達顯著降低(P<0.05)。PGE2受體拮抗組小鼠肝臟CD8+T淋巴細胞中Tim3的表達顯著降低(P<0.05)，TNF-α的表達顯著增加(P<0.05)，IFNγ的表達無顯著變化。3組小鼠肝臟中CD8+T淋巴細胞的占比差異無統計學意義。見表4。

表4 各組小鼠肝臟中CD8+T淋巴細胞功能對比(%, ±s)

注：與對照組相比，*P<0.05

討 論

研究報道，具有致病表型的Th17細胞可介導PGE2促進HBV誘導的免疫損傷[11-12]。本研究結果顯示，PGE2在CHB患者血清中的水平顯著高于健康體檢者，且PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST的含量顯著高于PGE2低水平患者，這些結果提示CHB患者肝損傷可能與PGE2水平的增加有關，且由于血清HBV DNA含量的增加，推測PGE2促進HBV復制可能是其誘導肝損傷的機制之一。但是PGE2參與多種細胞活動的調節過程，此推斷是否成立還需要進一步驗證。

研究報道，抑制性受體的持續表達與T細胞免疫衰竭有關[13]。本研究顯示，PGE2高水平患者血清中CD8+T細胞Tim3的表達顯著增加，提示PGE2可能是通過調控抑制性受體Tim3的表達來促進T細胞衰竭。對慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染和HIV感染的研究中發現，PGE2對CTL細胞的存活及有效性具有抑制作用[14-15]。CTL細胞釋放的穿孔素和顆粒酶可殺傷靶細胞(病毒、腫瘤細胞等抗原物質)，對腫瘤及感染類疾病的治療具有積極的作用。本研究發現，PGE2高水平患者血清中顆粒酶B的表達顯著低于PGE2低水平患者，穿孔素的表達也有降低的趨勢但差異無統計學意義，由此推斷PGE2可降低CTL細胞釋放的穿孔素和顆粒酶，進而抑制CTL細胞對病毒的殺傷性。

PGE2通過與其受體(EP1、EP2、EP3和EP4)結合調控炎癥、免疫反應、血壓等多種病理過程[16-17]。為探討PGE2及其受體在HBV感染后病毒復制及CD8+T細胞免疫調控中的作用，本研究將PGE2穩定類似物或者PGE2受體(EP2和EP4)拮抗劑注射入rAAV8-1.3HBV質粒感染小鼠體內，結果發現PGE2類似物可增加HBV感染小鼠血清中HBV DNA的水平，而PGE2受體拮抗劑顯著降低HBV DNA水平，這些結果進一步證實PGE2可通過與其受體EP2和EP4結合，進而促進HBV的感染及復制過程。

血清中pgRNA的含量可反映肝臟中HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)的活性，HBV cccDNA可形成微染色體穩定存在于細胞核中，其難以清除是HBV感染慢性化和停藥后復發的重要原因[18]。因此檢測血清中pgRNA水平對于評價HBV感染進程及復發具有重要的指導意義。本研究中，PGE2類似物顯著增加HBV感染小鼠血清中pgRNA的水平，PGE2受體拮抗劑顯著降低pgRNA的水平。提示PGE2在評價HBV感染進程及復發中具有重要意義，且PGE2受體阻斷能顯著縮短HBV感染進程，降低復發。

雖然PGE2及其受體拮抗劑對CD8+T細胞的數量無影響，但PGE2可能影響CD8+T細胞的功能。檢測CD8+T細胞抑制性受體(Tim3)及細胞因子(TNF-α和IFNγ)的表達結果證實，PGE2類似物顯著增加CD8+T細胞Tim3的表達，降低TNF-α和IFNγ的表達。PGE2受體拮抗劑有相反的作用。TNF-α可抑制腫瘤發生和病毒復制[19]，IFNγ是免疫干擾素，在抗病毒的先天免疫反應及適應性免疫反應中發揮重要作用[20]。因此這些結果進一步證實PGE2促進HBV的復制，且損傷CD8+T細胞的免疫清除。PGE2受體拮抗劑可緩解T細胞的免疫衰竭。本研究也有不足之處，樣本量太少、缺乏細胞水平的研究及對機制的深入探討，將會在后續研究中進行深入分析。

總之，PGE2在CHB患者血清中呈高表達，PGE2促進HBV復制及T細胞衰竭，PGE2信號阻斷不僅可修復T細胞功能還可控制HBV復制。因此PGE2阻斷將可能成為CHB患者治療的新策略。