肝癌患者腸道微生態結構變化的特點分析

孫亮 周旋 劉桂治 林茂銳 李明友 曹東林

原發性肝癌是全球男性癌癥死亡的主要原因之一，腸道微生態是一個包含著大量腸道微生物的復雜生態系統，其可以通過肝-腸循環參與到肝癌的致病過程中[1-3]。動物研究發現，腸道微生物菌群紊亂與肝癌關系密切[4-6]。本研究探索了原發性肝癌患者腸道菌群結構的變化，現報道如下。

資料與方法

一、病例資料

選擇2017年9月至2018年12月廣東省第二人民醫院診療的原發性肝癌患者87例，其中男55例，女32例，年齡32～71歲，平均(58.3±8.7)歲。入選標準：病理確診為原發性肝癌患者。排除標準：伴發其他臟器原發性惡性腫瘤者，曾使用過放化療、生物或者免疫治療者，入組1個月前曾使用過益生菌者，伴發急慢性胃腸道感染性或免疫異常疾病者。另取健康體檢者80名作為對照，其中男52名，女28名，年齡30～72歲，平均(58.1±8.7)歲。原發性肝癌與健康對照組在性別和年齡組成方面具有可比性，差異無統計學意義(P>0.05)。

二、微生物基因組DNA制備

無菌環境下收集入組患者中段糞便，使用糞便基因組DNA 快速提取試劑盒(購自北京艾德萊生物科技有限公司)，按照說明書提取總DNA。通用引物擴增16S rDNA V3-V4區，引物由深圳華大基因設計合成，引物序列16S rDNA:上游引物 5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG -3′，V3-V4區:下游引物 5′-ACGA-GCTGACGACARCCATG -3′。擴增條件：94 ℃預變性4 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR試劑盒購自大連寶生物公司，1%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增樣品后，紫外燈下切膠回收PCR擴增產物，使用DNA 凝膠回收試劑盒(美國基因公司產品)純化PCR擴增產物，通過Illumina平臺進行高通量測序(天津生物芯片技術有限責任公司)。

三、測序數據分析

將測序數據輸入開源微生物種群分析軟件包QIIME，運行工作流pick_de_novo_otus.py腳本程序，作α多樣性分析，然后以 97%以上相似度的標準聚類成一類OUT，比對OTU代表序列，對每個OTU進行物種分類，構建系統發育樹，總結OTU信息，總結分類組成的群落。通過Anosim相似性分析對比原發性肝癌患者和對照組間微生物菌群的差異。

四、統計學方法

結 果

一、原發性肝癌組和健康對照組間α多樣性

α多樣性中的Chao1 指數、Simpson指數、Shannon指數和 Gini指數在原發性肝癌組和健康對照組間差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 原發性肝癌組和健康對照組間α多樣性的比較

二、原發性肝癌組和健康對照組門水平菌群結構

肝癌組擬桿菌門和變形菌門所占百分比顯著高于健康對照組。肝癌組厚壁菌門和放線菌門所占百分比顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 原發性肝癌組和健康對照組門水平菌群結構的比較(%，±s)

三、原發性肝癌組和健康對照組屬水平菌群結構

肝癌組擬桿菌屬和大腸桿菌螺旋桿菌屬所占百分比顯著高于健康對照組(P<0.01)。肝癌組雙歧桿菌屬和梭菌屬所占百分比顯著低于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 原發性肝癌組和健康對照組屬水平菌群結構的比較(%，±s)

討 論

定植于人體胃腸道的細菌參與了各系統器官多種疾病的發病過程，肝-腸循環使腸道菌群和肝臟之間聯系起來[7, 8]。細菌培養是菌群鑒定的主要方法，但目前只有30%的腸道菌群可以培養，隨著分子生物學技術的進步，特別是Illumina 公司推出的 Hi Seq 高通量測序系統為腸道菌群的基因組學研究提供了方便[9-11]。本研究使用第二代高通量測序技術檢測發現原發性肝癌組和健康對照組間反應α多樣性的Chao1 指數、Simpson指數、Shannon指數和 Gini指數差異無統計學意義，說明了兩組間腸道微生態的物種多樣性或豐度方面無顯著性差異。

門屬分析顯示，肝癌組擬桿菌門和變形菌門比例顯著高于對照組，而厚壁菌門和放線菌門所占比例顯著低于對照組，以及擬桿菌門中的擬桿菌屬和變形菌門中的大腸桿菌螺旋桿菌屬比例顯著高于對照組，放線菌門中的雙歧桿菌屬和厚壁菌門中的梭菌屬著低于對照組。上述結果說明了肝癌患者腸道微生物系統中菌群主要以擬桿菌屬和大腸桿菌螺旋桿菌屬為主，擬桿菌屬具有特殊鞘脂結構，代謝中鞘脂失衡可導致細胞周期的紊亂，大腸桿菌螺旋桿菌屬過生長，可抑制雙歧桿菌、乳桿菌等潛在有益菌的生長繁殖[12-17]。本研究結果顯示，肝癌患者中雙歧桿菌屬比例的降低，梭菌屬中的乳桿菌和腸球菌對機體是有益的，而且有利于黃曲霉毒素的降解[18-20]。調控這種菌群的失衡是否有利于肝癌的臨床療效改善有待進一步的研究。

綜上所述，肝癌患者腸道微生態系統中擬桿菌屬以及其隸屬的擬桿菌門，大腸桿菌螺旋桿菌屬以及其隸屬的變形菌門所占比例明顯著高于對照組，雙歧桿菌屬以及其隸屬的放線菌門和梭菌屬以及其隸屬的厚壁菌門所占比例明顯著低于對照組，調節這種腸道微生態系菌落的平衡可能是輔助治療肝癌的新靶點。