捏法對大鼠至陽穴皮膚內(nèi)源性大麻素受體的影響

吳倩雯，余文英，黃 華，黃明愉，林麗莉

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州350122）

捏法是以捏、捻、提等復(fù)合式手法為主，將脊骨處皮膚提起捻動的操作手法，源于捏脊手法，是一種對局部皮膚的機(jī)械力刺激。 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endogenous cannabinoid system，ECS）由大麻素受體、內(nèi)源性大麻素及其合成和降解的酶組成［1］，在表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層均有分布［2－3］，參與調(diào)節(jié)皮膚免疫［4］、炎性反應(yīng)及損傷修復(fù)［2－3］，其中，大麻素受體主要包括內(nèi)源性大麻素受體1（CB1）和內(nèi)源性大麻素受體2（CB2）［1］。 研究表明：皮膚中的CB1 和CB2 可 能 參 與 抗 炎［5］及 皮 膚 損 傷 修 復(fù)［2］，CB2 還 與鎮(zhèn)痛效應(yīng)有關(guān)，阻斷CB2 可使電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)減弱［6］。有人以系統(tǒng)評價的方法發(fā)現(xiàn)按摩能夠激活ECS［7］。捏法作為一種按摩手法，對于ECS 的影響尚不明確，因此，我們采用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測方法，觀察不同強(qiáng)度的捏法刺激對CB1 和CB2 的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠24 只由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，6～7 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。 實驗環(huán)境符合國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，室溫保持在（22±2）℃，光／暗周期為12／12 h，動物自由取食和飲水。

1.2 主要試劑和儀器 RIPA 裂解液（強(qiáng)）、PMSF、BCA 定量試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CB1 一抗、β-actin 一抗（武漢三鷹有限公司）；CB2 一抗（武漢澳波泰克生物科技有限公司）；HRP 鼠抗兔IGg 二抗（南京諾維贊生物科技有限公司）；Stripping Buffer 洗脫液、ST 16R 高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；Infinite M200 PRO 全自動酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 24 只大鼠編號后按照隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、輕刺激組、中刺激組、重刺激組，每組各6 只。

2.2 干預(yù)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，空白組大鼠僅模擬抓取動作，不做任何治療；輕、中、重刺激組于至陽穴分別給予捏法7、14、21 次，每天1 次，每周刺激5 d，休息2 d，連續(xù)3 周。 至陽穴位于背中線第7、第8 胸椎棘突間，參照于曙光主編《實驗針灸學(xué)》［8］附錄圖選取。 捏法的具體操作：以左手固定大鼠及局部棘突，右手拇指伸直，以拇指與食指、中指螺紋面將皮膚捏起， 力度以大鼠不尖叫為度， 約2下／s 的頻率進(jìn)行捏捻。 捏脊由同一人操作，實驗前進(jìn)行手法培訓(xùn)，嚴(yán)格按照要求操作。

2.3 至陽穴皮膚取材 干預(yù)3 周后取材。 各組大鼠麻醉后，局部脫毛，取各組大鼠至陽穴部位包含真皮乳頭層、真皮網(wǎng)織層、皮下組織層的皮膚，體積約0.7 cm×0.7 cm×0.5 cm，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.4 皮膚內(nèi)源性大麻素受體含量檢測 取樣后液氮下研磨，以組織（g）∶裂解液（μL）＝1∶50 的比例加入組織裂解液，冰上超聲研磨后，4℃，14 000 r／min離心15 min，取上清液，BCA 法定量。 進(jìn)行Western blot 檢測： ①取13 μL 定量后樣品， 用10% SDSPAGE 凝膠電泳分離后，半干轉(zhuǎn)至PVDF 膜。 ②轉(zhuǎn)膜后將PVDF 膜用脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST洗滌8 min；放入一抗中4 ℃搖床過夜后，TBST 洗滌3 次，每次5 min；放入二抗中常溫1 h，TBST 洗滌3 次后顯影；以β-actin 為內(nèi)參，顯影后Stripping Buffer 洗脫液洗脫后重新封閉，加入β-actin 一抗，重復(fù)上述流程。③超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，按照試劑盒說明書配置顯影液， 采用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集及處理，通過光密度計算指標(biāo)與內(nèi)參的體積比值，即為蛋白相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22．0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 計量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，兩兩比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

4 組至陽穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對表達(dá)量見圖1、圖2 及表1。

圖1 4 組至陽穴皮膚CB1 蛋白相對表達(dá)量

圖2 4 組至陽穴皮膚CB2 蛋白相對表達(dá)量

表1 4 組至陽穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對表達(dá)量（±s）

表1 4 組至陽穴皮膚CB1、CB2 蛋白相對表達(dá)量（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與重刺激組比較，3） P＜0.01。

CB2 0.33±0.13 0.64±0.232）0.67±0.182）0.56±0.15組別空 白 組輕刺激組中刺激組重刺激組n 6 6 6 6 CB1 0.53±0.09 0.49±0.143）0.53±0.093）0.78±0.121）

4 討 論

捏脊常用于兒童保健，具有提高免疫力、促進(jìn)生長發(fā)育的作用。 有研究者認(rèn)為諸多傳統(tǒng)體表刺激如針灸、整脊、按摩等方法對神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)保護(hù)作用的效應(yīng)，很有可能是依賴內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)介導(dǎo)實現(xiàn)的［9］。 本實驗中，在予以3 周的捏法后，大鼠皮膚內(nèi)源性大麻素受體表達(dá)發(fā)生了改變。 皮膚是人體最大的免疫器官，在許多人和鼠的細(xì)胞群如皮膚神經(jīng)纖維、肥大細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和附屬組織細(xì)胞中，可觀察到CB1 和CB2 的免疫反應(yīng)［4］，手法及針刺治療都能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生影響［9－10］。 捏法作為一種治療手法，能夠?qū)ζつw產(chǎn)生機(jī)械力刺激。 通過對至陽穴大麻素受體蛋白表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn)：不同刺激量的捏法對于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的效應(yīng)是不同的，且以中刺激和重刺激效果更為顯著，說明這種體表刺激的方式需要達(dá)到一定刺激量才能夠發(fā)揮作用。

但激活不同受體所需的刺激量有所不同。 由于分布的不同，CB1 與突觸可塑性更為相關(guān)，CB2 與免疫反應(yīng)更有關(guān)聯(lián)，因此不同強(qiáng)度的手法刺激影響的效應(yīng)有所不同。 CB2 功能的發(fā)揮更大程度上受外部刺激的影響［11］，較輕的捏法刺激就能對其產(chǎn)生影響。 至者，達(dá)也，又極也；陽中之陽，陽之至也曰“至陽”，至陽穴位于背部陰陽交關(guān)處［12］。刺激至陽穴能夠使CB2 表達(dá)增多而調(diào)動ECS 系統(tǒng)， 影響人體免疫反應(yīng)。 皮膚中表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層是兩種受體共同存在的區(qū)域，不同的是，CB2 在血管平滑肌、神經(jīng)纖維外膜及神經(jīng)纖維束束膜也有分布［3］，因此，CB2 激活所需的刺激強(qiáng)度較小或許與其更廣泛的分布有關(guān)。 其次，外周內(nèi)源性大麻素參與抗痛覺過敏，其作用主要通過CB1 來實現(xiàn)［13］，重刺激引起的CB1 表達(dá)增多可能與疼痛有關(guān)。重刺激干預(yù)下，CB1表達(dá)增多，CB2 增多不顯著，這或許是由于此時內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的作用更傾向于抗疼痛。 捏脊手法臨床上既應(yīng)用于保健，也應(yīng)用于治療，在腦癱患兒的治療中亦有應(yīng)用。 若僅為了提高免疫力，手法刺激應(yīng)更加輕柔；若為了治療腦癱等疾病，則應(yīng)采用相對更強(qiáng)的刺激，這與臨床實際是相符合的。

本實驗結(jié)果顯示：①一定刺激量的捏法刺激能夠激活ECS 系統(tǒng)，從而增強(qiáng)皮膚的抗炎與修復(fù)能力，這或許是捏脊手法起效的可能機(jī)制之一；②重刺激強(qiáng)度的捏法能夠使至陽穴皮膚CB1 表達(dá)增多，輕刺激與中刺激強(qiáng)度的捏法能夠使至陽穴皮膚CB2 表達(dá)增多，一定強(qiáng)度的捏法刺激可能提高皮膚修復(fù)及抗炎能力。

本實驗僅采用普通大鼠進(jìn)行實驗，尚未引入病理模型，選穴和手法也比較單一。 手法治療如何通過ECS 系統(tǒng)對疾病產(chǎn)生作用，仍需要進(jìn)一步研究。