P53、bFGF、PTEN 在濕熱型大腸管狀腺瘤患者中的表達(dá)強(qiáng)度研究

陳小玲，付肖巖，林建龍，林巧云，伍登煇，林芳峰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

大腸管狀腺瘤是腺瘤中最主要的一種，也是公認(rèn)的癌前病變，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示其癌變的轉(zhuǎn)化率高達(dá)4%～4.8%［1］。 管狀腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程伴隨著一系列基因蛋白表達(dá)的變化，其中突變型P53 蛋白（P53）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、抑癌基因（PTEN）均參與了細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成，被證實(shí)與多種包括腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)。 本課題旨在通過檢測(cè)濕熱型大腸管狀腺瘤患者以及腸鏡檢查未見異常的健康者中P53、bFGF、PTEN 表達(dá)強(qiáng)度的差異，并探討三者在不同上皮內(nèi)瘤變（IN）程度中表達(dá)強(qiáng)度的不同。

1 臨床資料

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 管狀腺瘤、IN 程度的判定標(biāo)準(zhǔn)參照《消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類》（2012 年）中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［2］，其中IN 程度分為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LGIN）和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HGIN）。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)專科協(xié)作組制定的“大腸息肉診療方案”［3］辨為濕熱證。主證：①腹痛拒按，脹滿不適；②大便溏泄或黏液便；③泄下不爽而臭穢；④大便秘結(jié)；⑤便血；⑥舌質(zhì)偏紅，舌苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)。 次證：①口干喜飲；②口苦；③肛門灼熱墜脹；④里急后重；⑤小便短赤或黃；⑥頭身困重。 診斷需具備主證至少2 項(xiàng)＋次證至少2 項(xiàng)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡30～70 歲；②自愿加入研究并簽署知情同意書者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①病理確診管狀腺瘤伴癌變或患有其他系統(tǒng)腫瘤者；②伴有明顯其他腸道疾病者；③妊娠、哺乳期婦女，或有心、肺、腎等重要臟器疾病者；④兼雜證型或無證可辨者。

1.5 一般資料 隨機(jī)選取2018 年2 月—2019 年10 月于我院消化內(nèi)鏡室行電子結(jié)腸鏡檢查確診為濕熱型大腸管狀腺瘤患者50 例為試驗(yàn)組，另隨機(jī)選取20 例腸鏡檢查未見異常的健康者為正常組。試驗(yàn)組男33 例，女17 例，年齡（55.82±6.76）歲，其中HGIN 者（HGIN 組）22 例，LGIN 者（LGIN 組） 28例。 正常組男9 例，女11 例，年齡（53.30±4.97）歲。

2 方 法

2.1 主要儀器及試劑 電子腸鏡（日本Olympus 公司，型 號(hào)：CF-H260AI）；高 頻 電 刀（德 國(guó)ERBE 公司，型號(hào)：ICC200）；染色機(jī)（美國(guó)Leica 公司，型號(hào)：ST5020）；Olympus 顯微鏡（日本OLYMPUYS 公司，型號(hào)：BX43）；濕盒、鼠抗人P53 單克隆抗體、兔抗人bFGF 多克隆抗體、兔抗人PTEN 多克隆抗體、DAB 顯色試劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

2.2 標(biāo)本采集 試驗(yàn)組采集濕熱型大腸管狀腺瘤患者電切術(shù)后瘤體為標(biāo)本，正常組以活檢鉗鉗取距肛約10～15 cm 處的腸黏膜組織為標(biāo)本。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟 先將組織包埋、切片（2～3 μm）、制片，放60 ℃烤箱中烘烤1 h 后浸泡在松節(jié)油中脫蠟；然后逐次放入無水乙醇、90%酒精、85%酒精、蒸餾水中各10 min；約2 L 枸緣酸緩沖液加入高壓鍋中，加熱沸騰后放入切片，然后加閥加熱1～2 min，流水冷卻壓力鍋后再用蒸餾水沖洗切片；滴加過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次；除去PBS 緩沖液后，于兩張玻片上分別滴加適當(dāng)量的P53、bFGF、PTEN 抗體，置于室溫下孵育60 min；后同樣用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗3 次，取出玻片，保存于濕盒中；滴加二抗，室溫下孵育15～30 min 后，用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗3次；滴加適度DAB 工作液后，室溫中孵育3～5 min，顯色完全后蒸餾水沖洗終止顯色；用蘇木精復(fù)染30 s～2 min，后將組織玻片浸入梯度酒精（75%～100%）中脫水，每級(jí)時(shí)間控制2 min；最后行透明、封片、攝片。

2.4 P53、bFGF、PTEN 表達(dá)強(qiáng)度判定 P53、PTEN定位于細(xì)胞核，bFGF 主要定位于細(xì)胞核，部分定位于細(xì)胞漿，均以清晰棕黃顯色為陽性。 采用半定量積分法［4］判定表達(dá)強(qiáng)度：每個(gè)切片隨機(jī)選不重復(fù)的5 個(gè)視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)腺瘤細(xì)胞，分別對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)及顯色程度進(jìn)行分級(jí)記分，最終由兩類積分乘值判定表達(dá)強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用單因素方差分析，等級(jí)資料采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。

4 結(jié) 果

4.1 P53、bFGF、PTEN 在試驗(yàn)組和正常組表達(dá)強(qiáng)度比較 試驗(yàn)組中P53、bFGF 表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常組（P＜0.05），PTEN 表達(dá)強(qiáng)度則低于正常組（P＜0.05），見表1。

表1 P53、bFGF、PTEN 在試驗(yàn)組和正常組表達(dá)強(qiáng)度比較

4.2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度組表達(dá)強(qiáng)度比較 P53、bFGF 在HGIN 組中表達(dá)強(qiáng)度明顯高于LGIN 組（P＜0.05），PTEN 在HGIN 組中表達(dá)強(qiáng)度明顯低于LGIN 組（P＜0.05），見表2。

表2 P53、bFGF、PTEN 在不同IN 程度組表達(dá)強(qiáng)度比較

5 討 論

腺瘤是結(jié)直腸癌癌前病變，通過對(duì)腺瘤早發(fā)現(xiàn)、早治療來防治腸癌已成為業(yè)內(nèi)共識(shí)［5］。 癌變過程并非一蹴而成，如何能提前發(fā)現(xiàn)，及時(shí)阻斷或延緩腺瘤癌變的發(fā)生發(fā)展，這對(duì)腸癌的防治具有重要意義。 目前，雖無統(tǒng)一的腺瘤辨證分型，但大多醫(yī)家認(rèn)為其病因是在先天不足的基礎(chǔ)上伴隨后天的脾胃損傷，脾虛不運(yùn)，痰濕內(nèi)蘊(yùn)大腸，日久化熱，發(fā)為腸瘤［6-7］。 可見，濕熱證是腺瘤臨床較為常見的證候類型［8-10］。

P53 是一種抑癌基因，但突變形成的突變型P53會(huì)誘發(fā)腫瘤的生成［11-12］。 bFGF 能通過促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂加速腫瘤生長(zhǎng)，且通過誘導(dǎo)血管增殖來加速腫瘤轉(zhuǎn)移［13］。 PTEN 則是一種通過調(diào)控細(xì)胞周期來影響癌細(xì)胞增殖、凋亡的抑癌基因［14］。

本研究結(jié)果顯示：P53、bFGF 在試驗(yàn)組中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常組，而PTEN 的表達(dá)強(qiáng)度則明顯低于正常組；且試驗(yàn)組中P53、bFGF 在HGIN 組中表達(dá)較LGIN 組升高，PTEN 在HGIN 組中表達(dá)較LGIN 組下降。 可見，從正常黏膜到管狀腺瘤，從LGIN到HGIN 的瘤變過程中，存在著P53、bFGF 表達(dá)上調(diào)及PTEN 表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)三者表達(dá)失衡對(duì)管狀腺瘤的瘤變進(jìn)展起到一定作用。 結(jié)合課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在大腸管狀腺瘤中P53 的高表達(dá)可能與濕熱證有關(guān)，濕熱證是一個(gè)應(yīng)引起重視的證型［15］。 本研究同樣顯示，濕熱證管狀腺瘤中P53 呈現(xiàn)高表達(dá)，提示其機(jī)體抑癌保護(hù)機(jī)制受損可能更為明顯。 因本試驗(yàn)的局限性，未能對(duì)各中醫(yī)證型與各蛋白表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入分析，有待未來進(jìn)一步完善相關(guān)研究。