鴉膽子油口服乳液對甲基芐基亞硝胺誘發的大鼠食管癌變的作用及氧化應激的影響

施文榮，涂春香，陳 玲，余文珍，劉 艷

（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122）

藥理研究發現：鴉膽子油口服乳液（brucea java oil emulsion，BJOE）有抗腫瘤作用，目前臨床已應用于食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療［1-5］，但是BJOE 應用于腫瘤治療中通常是與化療劑連用，起到輔助作用，單獨應用BJOE 治療腫瘤的報道不多。 另外，關于鴉膽子作用機理方面研究發現，鴉膽子可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤轉移和血管生成等機制抗腫瘤［6］。 抗氧化應激也是腫瘤治療的常見機制，已知鴉膽子油具有一定的抗氧化作用［7］，但是也有報道指出，鴉膽子油能通過增強腫瘤組織的氧化損傷起到抗腫瘤作用［8］，存在矛盾。 所以有必要弄清氧化應激在鴉膽子油抗癌效應中的作用。

已知氧化應激是食管癌的形成過程的重要因素［9-10］，亞硝胺類化合物是環境中普遍存在的強致癌污染物，是食管癌的常見誘因。 甲基芐基亞硝胺（MBNA）誘發的大鼠食管癌模型是目前公認的食管癌化學預防模型，該模型病理形態改變與人食管鱗癌的發生順序平行［11］。本研究利用MBNA 誘發的大鼠食管癌模型探討BJOE 的抗腫瘤作用及與氧化應激的關系，為BJOE 的藥理研究提供參數，也為BJOE的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar 雄性大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），體質量180～200 g，生產許可證：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 藥物與試劑 MBNA 由本實驗室有機合成；BJOE（沈陽藥大雷允上藥業有限責任公司，批號：271601051）；RNA 組織保存液（上海華舜生物工程公司）；Trizol 試劑、SuperScript Ⅲ逆轉錄試劑盒、定量PCR 檢測試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；總抗氧化能力檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）測試盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；所用引物由上海生工生物工程公司根據設計合成。

1.1.3 主要儀器 SDS-PAGE 電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 參考文獻［12］制備Wistar 大鼠食管癌模型，32 只大鼠隨機分成正常組8 只和造模組24 只，造模組以MBNA 3.5 mg／kg 每周2 次頸背部皮下注射，正常組頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液連續注射15 周。 成模大鼠按體重分層隨機分為模型組、BJOE 高劑量組（高劑量組）、BJOE低劑量組（低劑量組），每組8 只。 于第16 周開始，高、低劑量組分別以BJOE 12、6 mL／kg 灌胃給藥，模型組和正常組以6 mL／kg 蒸餾水灌胃，每日1 次，共10 周。 根據實驗動物等效臨床劑量換算，高、低劑量組中藥給藥劑量相當于成人日劑量（1 mL／kg）的2 倍和1 倍。

1.2.2 食管黏膜病理觀察 實驗結束時處死4 組大鼠，沿食管縱行剖開，于解剖鏡下觀察食管黏膜病變情況，拍照記錄。 取典型病變組織用10%中性福爾馬林固定液固定，常規制片，HE 染色，光鏡觀察病理組織學變化。 余下食管保存于RNA 保存液中，用于提取食管組織總RNA。

1.2.3 氧化應激指標檢測 各組大鼠食管癌造模15 周末，尾靜脈采血，分離各組血清；實驗結束后處死大鼠，分離各組血清待測。 取大鼠肝組織約200 mg液氮反復凍融3 次，加入0.1 moL／mL PBS（pH 7.2）1 mL，低溫研磨制備20%肝組織勻漿，4 ℃3 000 r／min 離心15 min，取上清于-80 ℃凍存備用。血清及肝組織SOD、GSH-Px、總抗氧化能力、MDA 測定按試劑盒說明書進行。

1.2.4 基因轉錄水平檢測 抗氧化通路相關基因細胞色素P450 酶1A1（CYP1A1）、細胞色素P450 酶2E1（CYP2E1）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽S-轉硫酶M1（GSTM1）、醌氧化還原酶1（NQO1）、甲基轉移酶（MT）、乙酰基轉移酶（NAT）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、轉錄因子NF-E2 相關因子2（Nrf2）、Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）轉錄水平檢測采用Real-time RT-PCR 法。 實驗結束后用Trizol 法提取4 組大鼠食管組織總RNA，核酸蛋白分析儀檢測A260 nm／A280 nm 比值，計算RNA 濃度；瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。使用SuperScript Ⅲ逆轉錄試劑盒將總RNA 中的mRNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA 為模板進行熒光實時定量PCR 檢測（SYBR 染料法），擴增條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個循環。 反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線，以β-actin 為內參基因， 用2-△△Ct值表示目的基因轉錄水平。 各基因引物及擴增產物片段長度見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 進行數據分析，計量資料屬正態分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 實驗過程中，正常組大鼠皮毛柔順，有光澤，對外界刺激反應較靈敏；其余各組大鼠逐漸出現活動減少，食量下降，聳毛，毛色無光澤、易脫落，對外界刺激反應較遲鈍等現象。

2.2 MBNA 誘變15 周及BJOE 作用10 周后造模組與正常組體質量比較 見表2、表3。

表2 MBNA 誘變15 周造模組與正常組體質量比較（±s）g

表2 MBNA 誘變15 周造模組與正常組體質量比較（±s）g

注：與正常組比較，1） P＜0.01。

組別正常組造模組n 8 24造模前212.143±6.769 214.286±7.488造模后390.357±15.250 332.180±44.8751）

2.3 食管大體形態學及病理組織學變化 正常組大鼠食管黏膜光滑平整，未見明顯異常；模型組，高、低劑量組大鼠食管黏膜均出現全段病變，食管黏膜粗糙，黏膜表面有細小顆粒樣突起，出現乳突瘤樣改變，成瘤率為100%。實驗結束后，高、低劑量組食管黏膜的病變程度與模型組比較未見明顯差異，結果見圖1。 病理組織學顯示：正常組大鼠食管黏膜上皮細胞1～3 層，細胞排列均勻，基底細胞層規整，未見異常改變；高、低劑量組病理組織學檢查結果與模型組無明顯差異，均表現為上皮細胞明顯增生，層次增多，細胞排列紊亂，細胞向管腔方向增生。 結果見圖2。

表3 BJOE 作用10 周造模組與正常組體質量比較（±s）g

表3 BJOE 作用10 周造模組與正常組體質量比較（±s）g

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組n 8造模組24治療前390.357±15.250 330.385±45.892 342.692±44.563 323.462±44.845治療后424.714±11.789 329.167±46.6101）338.100±41.9691）283.556±42.8961）2）

圖1 4 組大鼠食管黏膜大體形態觀察圖

圖2 4 組大鼠食管黏膜病理組織學光鏡圖（HE 染色，×200）

2.4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應激指標及BJOE 作用10 周4 組大鼠血清及肝組織氧化應激指標比較 見表4～表6。

2.5 4 組大鼠食管組織抗氧化相關基因轉錄水平比較 見表7。

表4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應激指標比較（±s）

表4 MBNA 誘變15 周2 組大鼠血清氧化應激指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01。

組別正常組造模組n 8 24 SOD／U 5.254±2.668 5.021±0.901 MDA／（mmol／L）87.767±5.899 156.306±42.2812）GSH-Px／U 1287.342±147.439 1443.987±147.2401）總抗氧化能力／（mmol／L）1.595±0.154 1.569±0.174

表5 BJOE 作用10 周4 組大鼠血清氧化應激指標比較（±s）

表5 BJOE 作用10 周4 組大鼠血清氧化應激指標比較（±s）

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 SOD／U 2.309±0.293 2.188±0.409 1.924±0.288 2.359±0.125 MDA／（mmol／L）236.561±21.980 253.166±30.055 250.236±68.908 255.119±19.946 GSH-Px／U 1246.078±80.947 1272.549±113.495 1223.529±119.399 1345.098±55.598總抗氧化能力／（mmol／L）1.057±0.176 0.952±0.071 0.808±0.152 0.944±0.212

表6 BJOE 作用10 周4 組大鼠肝組織氧化應激指標比較（±s）

表6 BJOE 作用10 周4 組大鼠肝組織氧化應激指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 SOD／U 35.270±7.421 28.634±3.451 32.126±5.918 31.752±5.908 MDA／（mmol／L）18.446±2.657 22.263±5.515 18.421±3.930 30.422±10.3401）2）GSH-Px／U 243.345±33.750 223.441±56.195 179.836±57.228 232.266±46.722總抗氧化能力／（mmol／L）30.706±1.133 31.590±3.240 28.764±0.863 31.992±0.872

3 討 論

鴉膽子為苦木科植物，產于我國廣東、廣西、海南等地。BJOE 是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以大豆磷脂為乳化劑制成的水包油型乳劑，主要成分為鴉膽子油和豆磷脂。 現代藥理研究表明：鴉膽子油具有一定的抗腫瘤作用，BJOE 可顯著抑制肝癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞等腫瘤細胞的生長［13］，可抑制S180 小鼠移植瘤的生長，對Lewis 肺癌、Heps肝癌裸鼠移植瘤模型也有明顯的抑制作用［14］。但是，本研究結果發現，高、低劑量組與模型組比較，病理形態學與組織學均未有明顯改變：表明BJOE不能阻斷MBNA 誘導的大鼠食管癌變。可見，BJOE 雖然具有一定的抑癌作用，但是具有一定的選擇性，對MBNA 誘發的大鼠食管癌模型無效。考慮到目前單獨應用BJOE 抗癌作用的研究對象多是體外細胞模型和小鼠移植瘤模型， 對化學預防模型無阻斷作用，所以BJOE 的抗癌作用尚存在疑義，需要進一步實驗來證實。

表7 4 組大鼠食管組織抗氧化相關基因轉錄水平（±s）

表7 4 組大鼠食管組織抗氧化相關基因轉錄水平（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組n 8 8 8 8 n 8 8 8 8 CYP1A1 1.000±1.305 0.499±0.632 0.810±1.017 1.488±1.816 MT 1.000±1.300 0.453±0.284 1.999±2.917 1.593±2.167 CYP2E1 1.000±1.325 0.565±0.891 1.384±1.510 1.347±2.042 NAT 1.000±0.617 6.712±9.197 0.395±0.439 0.488±0.444 CAT 1.000±0.819 9.028±3.4601）7.627±8.056 2.034±0.7384）MTHFR 1.000±0.774 11.242±13.945 32.775±23.9041）46.954±6.0662）3）GSTM1 1.000±0.680 0.852±0.584 1.142±0.911 0.906±0.405 Nrf2 1.000±0.796 3.551±3.270 3.543±0.672 3.577±1.945 NQO1 1.000±0.733 0.188±0.167 0.614±0.714 0.740±0.885 Keap1 1.000±0.656 1.235±1.557 2.264±2.274 1.513±1.947

藥理研究表明：鴉膽子油具有一定的抗氧化作用。 然而我們前期研究發現：鴉膽子油提取物是通過增強腫瘤組織的氧化損傷起到抗腫瘤作用的，存在矛盾。 本研究探討商品化生產的BJOE 是否具有抗氧化作用，發現BJOE 作用10 周后，高劑量組肝勻漿MDA 含量顯著高于模型組，食管組織CAT 基因轉錄水平顯著低于模型組。 MDA 作為脂質過氧化產物，其含量增加表明體內過氧化程度加劇［15-16］，CAT 基因轉錄水平降低說明體內抗氧化的保護系統遭到一定的破壞，說明BJOE 對MBNA 誘發的模型大鼠食管癌變無抗氧化損傷作用，甚至加重了氧化應激程度。

在食管癌誘變過程中，氧化應激具有重要作用。誘變劑MBNA 在誘發食管癌模型過程中產生大量的自由基，引發的氧化應激對食管癌病變具有重要的促進作用。 另外，BJOE 在治療過程中也體現了加重氧化應激的作用，已知抗癌藥抗腫瘤機制之一就是誘導腫瘤細胞產生活性氧，損傷線粒體導致腫瘤細胞凋亡［17］，可見氧化應激對食管癌的發展進程是把雙刃劍。

另外，我們研究發現，商品化生產的BJOE 與實驗室經乙醚浸提的鴉膽子油對MBNA 誘發的食管癌模型大鼠抗腫瘤作用有一定的差異：乙醚浸提的鴉膽子油顯示出更強的毒性作用，對模型大鼠有微弱的抗腫瘤作用［8］；而商品化生產的BJOE 對該模型未顯示出可見的抗腫瘤效應。 出現這種結果，筆者認為主要是因為兩種藥物提取方法不同引起成分不同導致，乙醚浸提的鴉膽子油含有更多毒性物質。

最后，BJOE 在臨床多與化療聯用，以后相關抗癌藥理研究也應當結合化療劑綜合判定。