精制保和顆粒調(diào)控Bcl-2 和Bax 表達(dá)抑制大腸癌細(xì)胞移植瘤生長的作用機(jī)制研究

吳美珠，陳曉萍，褚劍鋒，沈阿靈，劉麗雅，林曉英，陳友琴，3*

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3. 美國凱斯西儲大學(xué)醫(yī)學(xué)院，美國 克利夫蘭44106）

大腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤，根據(jù)美國癌癥協(xié)會2019 年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，CRC 的發(fā)病率無論在男性還是女性當(dāng)中均位列前三，且逐年呈上升的趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康［1-3］。 目前大腸癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療和免疫治療等，但仍存在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥和毒副作用等問題［4］，嚴(yán)重影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量，因此尋求更加有效且低毒的抗腫瘤藥物尤為重要。 中醫(yī)學(xué)根據(jù)大腸癌發(fā)病及臨床特點(diǎn)認(rèn)為大腸癌應(yīng)屬“腸積”“積聚”“瘕”“腸風(fēng)”和“鎖肛痔”等范疇［5］，其病位在腸、脾、胃，臨床多表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)之證［6］，以腹痛、神疲乏力、納差、黏液膿血便、腹脹痛、便溏、腰膝酸軟、口渴、里急后重等為臨床常見癥狀體征［7］，因此，扶正驅(qū)邪是中醫(yī)藥治療大腸癌的主要治法治則。 保和丸是中醫(yī)經(jīng)典處方，具有消食化積、養(yǎng)胃和中等功效，臨床上常用于治療食積停滯、噯腐吞酸、不欲飲食等胃腸道癥狀［8-9］。 本研究采用的精制保和顆粒（refined baohe formula，RBF）為保和丸精簡化裁而來，由紅藤、神曲和炒麥芽組成，具有健脾和胃、化瘀解毒等功效。目前RBF對大腸癌生長的影響尚未見相關(guān)報(bào)道，因此，本研究通過建立皮下接種人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞構(gòu)建皮下移植瘤模型，并觀察RBF 對移植瘤生長、細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為RBF 的臨床抗大腸癌應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與動物 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。 無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級雄性BALB／c 裸鼠10 只，4～6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號為SCXK（滬）2014-0017，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級醫(yī)學(xué)動物房，許可證號為SYXK（閩）2014-0005。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640 培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清（美國Thermo Fisher 公司）；青鏈霉素混合液和磷酸緩沖鹽（美國Hyclone 公司）；基質(zhì)膠（美國BD 公司）；促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2和增殖細(xì)胞核抗體PCNA（美國CST 公司）；免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；TUNEL 檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；伊紅-蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；超凈工作臺（中國蘇凈集團(tuán)安泰公司）；DM 4000倒置顯微鏡和病理切片機(jī)（德國Leica 公司）；石蠟包埋機(jī)和生物組織自動脫水機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

1.3 藥物配制 精制保和顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1707310，研磨成粉，生理鹽水溶解配成3 mg／mL，超聲30 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 人結(jié)腸癌裸鼠荷瘤模型的建立和藥物干預(yù)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素）中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞經(jīng)消化、離心、計(jì)數(shù)后， 用無血清的細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠1∶1 混合后重懸，按0.1 mL／只（1×106個／只）接種于裸鼠腋窩處皮下，待瘤體生長至100 mm3左右，根據(jù)小鼠瘤體大小采用隨機(jī)法將小鼠分為對照組和RBF 組，每組5 只，分別給予等體積的生理鹽水和RBF 150 mg／（kg·d）溶液連續(xù)灌胃12 d。隔天分別采用電子天平測量裸鼠體重和游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑和橫徑，并計(jì)算瘤體的體積（V＝1／2 長徑×橫徑×橫徑）。

1.5 樣本采集 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剝離瘤塊，拍照，通過電子天平測量瘤體的重量后，通過4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)固定、包埋及HE 和免疫組化染色等相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.6 HE 染色觀察移植瘤組織形態(tài)變化 對經(jīng)4%多聚甲醛固定后的移植瘤組織進(jìn)行包埋、切片等處理，將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，并通過梯度乙醇水化，雙蒸水沖洗，蘇木素染色1 min，分色脫水，伊紅染色5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，通過倒置光學(xué)顯微鏡于200×下觀察組織形態(tài)。

1.7 TUNEL 法檢測組織細(xì)胞凋亡 按照TUNEL檢測試劑盒說明書檢測移植瘤組織中細(xì)胞凋亡情況。將石蠟切片脫蠟水化，滴加蛋白酶K 工作液，室溫孵育15 min，經(jīng)TBS 緩沖液漂洗后，加入含TdT酶和熒光標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）反應(yīng)液，于37 ℃孵育2 h；隨后，經(jīng)TBS 漂洗后用封閉液室溫孵育30 min，生物素化地高辛抗體37 ℃孵育30 min；經(jīng)TBS 漂洗干凈后滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC），37 ℃孵育30 min；TBS 漂洗后滴加DAB 顯色劑，室溫反應(yīng)5 min；PBS 漂洗后加蘇木素復(fù)染1 min，沖洗后脫水封片，通過顯微鏡下觀察拍照。 TUNEL 標(biāo)記陽性細(xì)胞判斷方法［10］如下：在光鏡下細(xì)胞核被標(biāo)記成棕黃色細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞；每片于400×視野下隨機(jī)選取5 個不同視野進(jìn)行陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，以同一視野內(nèi)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.8 免疫組化法檢測移植瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Bax 和Bcl-2 蛋白的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)及封閉后，于4 ℃條件下孵育一抗（Bax、Bcl-2、PCNA，稀釋比例均為1∶200）過夜；孵育結(jié)束后通過PBS 清洗3 次，每次5 min，并進(jìn)行二抗孵育30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，再與SABC 反應(yīng)，DAB 染色并蘇木素復(fù)染，脫水后封片。每組標(biāo)本隨機(jī)采集5 個高倍鏡視野（×400）拍照，采用Image-pro plus 7.0 分析系統(tǒng)，以細(xì)胞核呈棕黃色為陽性表達(dá)結(jié)果，以免疫組化評分代表蛋白相對表達(dá)水平。 按Fromowitz 綜合計(jì)分法［11］進(jìn)行判定如下：每張片子于400 倍視野下隨機(jī)選取5 個視野，計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，50%～75%為3 分，＞75%為4 分；細(xì)胞染色強(qiáng)度的評分以著色深度判定：基本不著色（陰性）為0 分，染色弱（淺黃色）為1 分，染色強(qiáng)度中等（黃色）為2分，染色強(qiáng)（棕黃色）為3 分。 按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分和染色強(qiáng)度評分的乘積為免疫組化評分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，兩個獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 RBF 干預(yù)對荷瘤裸鼠體質(zhì)量的影響 以往研究證實(shí)裸鼠體質(zhì)量的變化與藥物療效及毒性反應(yīng)均有密切聯(lián)系，荷瘤小鼠體質(zhì)量測量實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時2 組裸鼠之間的體質(zhì)量無明顯差別，說明RBF 對裸鼠的體質(zhì)量無明顯影響。

圖1 2 組裸鼠體質(zhì)量柱狀圖

2.2 RBF 干預(yù)對裸鼠移植瘤生長的影響 如圖2所示：與對照組比較，RBF 干預(yù)可以顯著延緩裸鼠移植瘤體積的增加，并在第11 天，與對照組比較瘤體體積顯著降低（P＜0.05）；從瘤體大體觀（圖3A）和瘤重（圖3B）的結(jié)果所示，與對照組比較，RBF 干預(yù)組的移植瘤大小和重量也均顯著減輕（P＜0.05）。研究結(jié)果提示RBF 干預(yù)可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。

圖2 2 組裸瘤體體積比較

圖3 2 組裸鼠瘤體大小（A）和瘤體重量（B）的比較

2.3 RBF 干預(yù)對移植瘤組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果如圖4 所示。對照組瘤體組織生長旺盛，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，生長狀態(tài)良好；而RBF 組瘤體組織壞死明顯，多數(shù)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞固縮甚至碎裂：提示RBF 干預(yù)對移植瘤組織有一定的影響。

2.4 RBF 干預(yù)對移植瘤組織中PCNA 表達(dá)的影響采用免疫組化法檢測裸鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖5 所示：對照組PCNA 的棕色陽性表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度均高于RBF 組；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對照組比較，RBF 組移植瘤組織中PCNA 的表達(dá)明顯下降 （P＜0.05）。 研究結(jié)果提示RBF 干預(yù)具有抑制移植瘤細(xì)胞增殖的作用。

圖4 2 組裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)比較（×200）

圖5 2 組移植瘤組織PCNA 表達(dá)的比較（×400）

2.5 RBF 對移植瘤組織中細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖6 所示：RBF 組中棕色陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)要明顯多于對照組，與對照組比較，RBF 組移植瘤組織凋亡率明顯增多（P＜0.05）：提示RBF 干預(yù)具有顯著誘導(dǎo)移植瘤組織中細(xì)胞凋亡的作用。

圖6 2 組裸鼠移植瘤組織凋亡細(xì)胞的比較（×400）

2.6 RBF 干預(yù)對移植瘤組織中Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響 免疫組化法檢測移植瘤組織促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)的結(jié)果如圖7 所示。RBF 組移植瘤組織中Bcl-2 未見明顯棕色染色細(xì)胞，且數(shù)量也明顯少于對照組，而Bax 棕色染色細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度均較對照組高；與對照組比較，RBF組移植瘤組織中Bcl-2 表達(dá)明顯降低，而Bax 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）：提示RBF 干預(yù)具有顯著下調(diào)Bcl-2 和上調(diào)Bax 表達(dá)的作用，可能是RBF 干預(yù)發(fā)揮抗大腸癌的機(jī)制之一。

3 討 論

大腸癌是機(jī)體在多種致癌因素共同作用下，引起細(xì)胞基因異常表達(dá)，細(xì)胞增殖和凋亡失衡，并最終表現(xiàn)為無限增殖的特征［12-14］，因此，抑制腫瘤細(xì)胞生長是治療大腸癌等惡性腫瘤的重要策略。 目前臨床常用藥物常存在化合物單一、靶點(diǎn)單一、途徑單一以及存在不同程度的毒副作用等不足，嚴(yán)重影響了患者的療效和生活質(zhì)量。 而中醫(yī)藥治療具有“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用與注重整體調(diào)節(jié)”等獨(dú)特的優(yōu)勢［15-16］。 本研究以清代陳復(fù)正《幼幼集成》保和丸為基礎(chǔ)，取該方的神曲、炒麥芽以健脾益氣、消食和胃，另加紅藤以奏健脾和胃、化瘀解毒的功效。近來研究表明紅藤具有抗炎、抗腫瘤等作用［17］，然而，目前精制保和顆粒對大腸癌的療效尚未見報(bào)道。本研究通過瘤體體積、重量等指標(biāo)檢測證實(shí)精制保和顆粒能夠一定程度的直接緩解移植瘤的生長。

增殖與凋亡失衡并呈現(xiàn)出無限增殖的特點(diǎn)是大腸癌等惡性腫瘤的重要特征。 PCNA 是一種非組織蛋白性的核蛋白，與細(xì)胞增殖和DNA 合成有關(guān)，可反映細(xì)胞增殖情況，是目前用于評估惡性腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)之一［18］。本研究通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)精制保和顆粒干預(yù)能夠顯著降低PCNA表達(dá)。 相反，凋亡抵抗是包括大腸癌在內(nèi)惡性腫瘤異常生長另一重要機(jī)制，這也使得促進(jìn)細(xì)胞凋亡已成為防治腫瘤的重要途徑。 本研究通過TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)精制保和顆粒具有顯著誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡的作用。 可見，通過抑制大腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是精制保和顆粒發(fā)揮抗大腸癌的重要途徑，然而，對血管新生、淋巴管新生等方面的影響和調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。

Bcl-2 家族是對細(xì)胞增殖、凋亡具有重要調(diào)控作用的一類基因，同屬該家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 可形成一個調(diào)節(jié)系統(tǒng)，Bcl-2 通過與Bax 競爭結(jié)合形成異源二聚體來抑制細(xì)胞凋亡，但Bcl-2 表達(dá)降低，Bax 表達(dá)升高時，細(xì)胞凋亡明顯增加，可抑制腫瘤細(xì)胞的快速增長［19］。 本研究通過免疫組化檢測精制保和顆粒干預(yù)對Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)精制保和顆粒干預(yù)具有顯著降低Bcl-2 表達(dá)和上調(diào)Bax 表達(dá)的作用。 可見，通過調(diào)控Bcl-2 和Bax 的表達(dá)可能是精制保和顆粒抑制大腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并最終發(fā)揮抑制大腸癌細(xì)胞生長的重要機(jī)制之一。 本研究結(jié)果為精制保和顆粒的臨床抗大腸癌應(yīng)用提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，然而，與其他復(fù)方相似，精制保和顆粒具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)，本研究僅從Bcl-2 和Bax 表達(dá)探討其抑制大腸癌細(xì)胞生長的機(jī)制仍有一定的局限性，仍有待進(jìn)一步采用測序等組學(xué)技術(shù)開展深入的機(jī)制研究。