半枝蓮對人結腸癌細胞SW620 增殖和凋亡的影響

黃雅娜，張 鈴，林 煒

（福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122）

結直腸癌是全球排名第三的癌癥且死亡率居第四位［1］，目前臨床上治療結腸癌主要以手術切除為主，輔以放療、化療和靶向藥治療等。 近年來，中醫藥在治療結腸癌上取得了一定的進展，其著重于減輕化療的毒副作用，改善癌癥患者生存質量。 半枝蓮是臨床上常用于治療結腸癌的中藥，其性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經，具有清熱解毒、化瘀利尿、消腫止痛等功效。 據《中國藥典》記載，半枝蓮常單用或聯合應用在肺癌、 乳腺癌和結直腸癌等腫瘤的治療，并取得了較好療效［2-4］。 本研究通過體外細胞實驗探討半枝蓮對人結腸癌SW620 細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材 料

1.1 細胞株 人結腸癌細胞株SW620 購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 藥物提取 取半枝蓮全草，粉碎后用85%乙醇回流提取3 次，合并提取液，壓濃縮至無醇味，加水混懸后，用氯仿進行萃取，即可得到半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB），后用旋轉蒸發儀蒸干待用。

1.3 試劑 RPMI-1640 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；PBS 緩沖液、雙抗（青霉素和鏈霉素）購自美國Hyclone 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、SDS-PAGE 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；DAPI 染色液、BCA試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；PCNA、Survivin、GAPDH 一抗、HRP 二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；PVDF 膜（美國GE 公司）。

1.4 儀器 CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；Infinite 200 PRO 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；垂直電泳槽、ChemiDocXRS+化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 ECSB 制備 稱取200 mg ECSB 溶于1 mL DMSO，制備成200 mg／mL 母液，4 ℃保存，干預細胞時用RPMI-1640 完全培養基配置成所需濃度。

2.2 細胞培養及干預 SW620 細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640 培養基于37 ℃、5%CO2條件下培養；當細胞匯合到80%左右后，用0.25%胰酶消化并傳代，用于后續實驗。 實驗分組：0 μg／mL 組、12.5 μg／mL 組、25 μg／mL 組、50 μg／mL 組、75 μg／mL 組。

2.3 MTT 法檢測細胞活力 取對數生長期細胞按1.0×105個／mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL；細胞貼壁后，加入0、12.5、25、50、75 μg／mL 的ECSB干預SW620 細胞24 h；24 h 后去除上清液， 加入100 μL MTT 于37 ℃孵育4 h；4 h 后去除MTT，再加入100 μL DMSO，用Infinite 200 PRO 多功能酶標儀在490 nm 處檢測OD 值。 按照以下公式計算細胞活力：（實驗組OD 值／對照組OD 值）×100%。

2.4 DAPI 染色檢測細胞凋亡 取對數期生長細胞，按照1×105個／mL 細胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預SW620 細胞24 h 后，用PBS 洗滌3 次；用4%多聚甲醛固定細胞5 min，每孔加入2 μg／mL DAPI 500 μL，37 ℃避光15 min，用PBS 清洗3 次。 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期 取對數期生長細胞， 按照1×105個／mL 細胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、50 μg／mL 的ECSB 干預SW620細胞24 h 和48 h 后， 棄去上清后，PBS 洗滌1 次；分別加入預冷的75%酒精固定4 h，PBS 洗滌3 次后加入500 μL PI，4 ℃避光染色30 min。 流式細胞儀檢測細胞周期。

2.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞中PCNA、Survivin 蛋白的表達情況 取對數期生長細胞，按照1×105個／mL 細胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL；加入0、25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預SW620 細胞24 h 后，用PBS 洗滌1 次；收集細胞后加入蛋白裂解液，渦旋4 次，每次靜置5 min，后12 000 rpm／min 離心20 min，吸取上清液即為所收集的蛋白樣品。 用BCA 法進行蛋白定量，后加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃金屬浴變性5～10 min。以50 μg 上樣量進行垂直電泳跑膠，電壓條件為：濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，55 min。 用PVDF 膜進行轉膜，轉膜條件為110 V，60 min。 轉膜后，用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，封閉后用PCNA（1∶1 000）和Survivin（1∶1 000）的一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗3 次，5 min／次； 用HRP 二抗（Rabbit，1∶10 000）室 溫 孵 育1 h，TBST 洗3 次，5 min／次。 最后用ECL 試劑顯影成像。

2.7 統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析。 計量資料屬正態分布的以（±s）表示，采用t檢驗和單因素方差分析，非正態分布的采用秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。

3 結 果

3.1 4 組抑制SW620 細胞活力比較 MTT 結果表明不同濃度（12.5、25、50、75 μg／mL）的ECSB 可顯著抑制結腸癌細胞SW620 的活力，并呈現明顯的劑量依賴，見表1。

表1 4 組抑制SW620 細胞活力比較（±s）

表1 4 組抑制SW620 細胞活力比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.01。

組別0 μg／mL 組12.5 μg／mL 組25 μg／mL 組50 μg／mL 組75 μg／mL 組細胞活力／%100.0±2.0 89.0±1.01）58.5±1.11）43.4±0.51）38.2±0.31）n 6 6 6 6 6

3.2 4 組對SW620 細胞凋亡和增殖影響的比較不同濃度（25、50、75 μg／mL）ECSB 處理SW620 細胞24 h 后，對細胞進行DAPI 染色，結果顯示：在ECSB 干預后出現了細胞核固縮，核碎裂，說明ECSB能促進SW620 細胞的凋亡，見圖1（箭頭所示）、表2。利用流式技術檢測細胞周期，結果顯示：用50 μg／mL ECSB 處理SW620 細胞24 h 后，其S 期與對照組無顯著性差異（P＞0.05），而進一步干預48 h 后，其S 期出現明顯的阻滯，說明ECSB 能抑制SW620細胞的增殖，見表3。

圖1 4 組SW620 細胞凋亡情況（×40）

表2 4 組促進SW620 細胞凋亡比較（±s）

表2 4 組促進SW620 細胞凋亡比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.01。

組別0 μg／mL 組25 μg／mL 組50 μg／mL 組75 μg／mL 組凋亡率／%2.7±0.1 6.5±0.71）9.5±1.21）31.8±1.41）n 3 3 3 3

表3 2 組抑制SW620 細胞增殖比較（±s）

表3 2 組抑制SW620 細胞增殖比較（±s）

注：與0 μg／mL 組比較，1） P＜0.05。

組別0 μg／mL 組50 μg／mL 組細胞S 期／%24 h 23.8±0.8 29.1±1.7 48 h 22.8±1.3 33.2±2.31）

3.3 4 組SW620 細胞中PCNA 和Survivin 表達不同濃度（25、50、75 μg／mL）ECSB 處理SW620 細胞24 h 后，檢測細胞中PCNA 和Survivin 的表達，結果顯示：與0 μg／mL 組比較，75 μg／mL 的ECSB能明顯降低Survivin 和PCNA 的表達（P 均＜0.05），見圖2、圖3、圖4。

4 討 論

結直腸癌屬中醫“鎖肛痔”“積聚”“腸覃”“腸癖”等范疇。 中醫認為結直腸癌病機為本虛標實，治療上以清熱解毒，活血化瘀為治療原則［5］。 中醫治療腫瘤的臨床用藥和實驗研究中，有60%以上的中藥為清熱解毒類藥物［6］。半枝蓮屬唇形科多年生草本，歸屬清熱解毒類中藥，現代研究表明：半枝蓮中多種有效活性化學成分具有良好的抗腫瘤活性，對治療肺癌、乳癌、肝癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤療效顯著［7］。

圖2 4 組SW620 細胞PCNA 和Survivin 蛋白表達電泳圖

圖3 4 組對SW620 細胞PCNA 蛋白表達比較

圖4 4 組SW620 細胞Survivin 蛋白表達比較

中藥治療腫瘤有兩個方面藥理機制：一是抑制腫瘤細胞的生長、增殖，從而阻止腫瘤的增大和擴散；二是促進腫瘤細胞凋亡壞死，進而使腫瘤組織縮小、消退。 本研究通過DAPI 染色和流式細胞術實驗證明：25、50、75 μg／mL 的ECSB 干預結腸癌細胞SW620 后呈現出較高的凋亡率，提示ECSB 抑制細胞增殖可能通過誘導細胞凋亡導致，從而達到抗腫瘤效果［8-9］。

細胞周期調控異常引起腫瘤細胞增殖失控是惡性腫瘤基本的生物學特征［10］。 PCNA 為增殖細胞核抗原， 其表達水平與腫瘤細胞增殖呈正相關，已成為反映細胞增殖的標記物之一。 Lin Wei 等［11］通過建立小鼠結腸癌皮下移植瘤模型，發現夏枯草可以通過顯著抑制PCNA 的表達，從而起到促進結直腸癌細胞凋亡，抑制細胞增殖。 細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的程序性死亡，可以維持機體的正常運轉，而在腫瘤細胞中，其細胞凋亡調控機制失常［12］。Survivin 是凋亡抑制基因家族的成員之一，具有抑制細胞死亡和控制有絲分裂的功能。 Survivin在大多數健康成人組織中檢測不到，而幾乎在所有人類腫瘤中均顯著表達。 在結腸直腸癌患者中，Survivin 的高表達與不良預后、生存期縮短以及體內腫瘤細胞凋亡減少有關［13］。 Yujiro Fujie 等 認為Survivin 是細胞凋亡和有絲分裂突變的關鍵分子，奧沙利鉑能有效抑制Survivin，與某些化學試劑聯合使用時，可通過促進細胞凋亡和有絲分裂突變而發揮明顯的作用［14］。本研究發現：ECSB 可能是通過下調SW620 細胞的Survivin 促進SW620 細胞的凋亡，通過下調PCNA 來抑制細胞的增殖，從而最終顯著抑制SW620 細胞的活力。

本研究探討半枝蓮對腫瘤細胞增殖、凋亡方面的影響，為其臨床治療結直腸癌提供科學依據。 但腫瘤細胞的增殖和凋亡受到眾多機制的復雜調控，半枝蓮對人結腸癌細胞的增殖及凋亡是否涉及其他信號通路，有待進一步研究探討。