環介導技術在細菌性痢疾檢測中的應用

王 偉, 張瑞蓮, 玄立印, 王海連

(1.河北省承德市疾病預防控制中心微生物室， 河北 承德 067000 2.河北省豐寧縣黃旗鎮中心衛生院， 河北 豐寧 067000 3.河北省寬城縣疾病預防控制中心， 河北 寬城 067000)

環介導技術在細菌性痢疾檢測中的應用

王 偉1, 張瑞蓮2, 玄立印3, 王海連1

(1.河北省承德市疾病預防控制中心微生物室， 河北 承德0670002.河北省豐寧縣黃旗鎮中心衛生院， 河北 豐寧0670003.河北省寬城縣疾病預防控制中心， 河北 寬城067000)

目的建立環介導等溫擴增法(LAMP)檢測腸道門診感染性腹瀉病例志賀菌。方法應用Primer Explorer V5軟件設計針對志賀菌的保守區引物，建立LAMP檢測方法，采用熒光定量PCR法、LAMP法和分離培養法三種方法，對760例承德醫學院附屬醫院腸道門診腹瀉患者糞便標本進行檢測。對建立的方法進行特異度、靈敏度試驗,與熒光定量PCR、培養法進行比對。結果3種方法的檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)。LAMP檢測方法具有良好的敏感度和特異度。結論LAMP法使用水浴鍋進行等溫擴增，結果可在可見光或紫外燈下直接肉眼觀察。LAMP檢測方法靈敏特異，簡單快速，無需特殊儀器，可廣泛用于基層疾控醫療機構志賀菌的檢測。

志賀菌； 熒光定量PCR法； 環介導等溫核酸擴增技術； 檢 測

志賀菌(Shigella)是腸桿菌科一種傳染性較強、危害嚴重、可在人和動物腸道內寄生的革蘭陰性無芽胞桿菌，屬于常見食源性致病菌，所致的細菌性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是發展中國家重要的傳染病之一[1]。據統計，全世界每年細菌性痢疾患者高達1.65億，發展中國家的病例人數占98%,每年約110萬死亡病例,其中5歲以下兒童為60%。目前，在我國，國標法(GB/T4789.5-2013)仍然是志賀氏菌檢驗的最常用的方法，但耗時長，敏感性差，PCR方法具有靈敏、快速等優點，但檢測成本較高，儀器昂貴，不適于基層單位應用[2,3]。因此，建立一種快速、準確、操作簡便的檢測方法對疾病診斷、控制和流行病學調查具有重要意義。環介導等溫擴增技術 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 2000年由日本榮研株式會社 Notomi 等[4]研發的一種新的核酸擴增方法。其方法依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下反應1 h～2 h高效完成目的基因擴增。本研究運用LAMP技術原理，根據以志賀菌侵襲性質粒抗原 H 基因(ipaH)中的保守區，設計4條特異性引物，對標準菌株痢疾志賀菌進行檢測，建立的LAMP檢測技術,并對反應體系進行優化后，應用于實際樣品的檢測，與熒光PCR法進行比較。

1 材料與方法

1.1標本：2016年承德醫學院附屬醫院腸道門診腹瀉患者糞便標本；

1.2菌株：福氏志賀菌、宋氏志賀菌、痢疾志賀菌、腸炎沙門桿菌、鼠傷寒沙門桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單核細胞增生李斯特菌由河北省CDC提供。

1.3儀器：ABI7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電熱恒溫水浴鍋(美國熱電公司)；BIO-RAD電泳儀和凝膠成像系統(美國伯樂公司)；Eppendorf mini spain離心機(德國艾本德公司)。

1.4試劑：志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、麥康凱(MAC)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂、志賀氏菌顯色培養基、三糖鐵(TSI)瓊脂、營養瓊脂斜面均購自北京陸橋公司；API20E生化鑒定試劑購自青島新元生物技術有限公司；Bst DNA聚合酶(批號：0000128457)購自Promega公司；志賀氏菌核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，所有試劑均在有效期內使用。

1.5方 法

1.5.1DNA模板制備：按照志賀氏菌核酸檢測試劑盒要求，便標本取黃豆粒大小用0.5mL生理鹽水稀釋，標準菌株取其增菌液lmL至離心管中，振蕩后，13000rpm離心2min，棄上清，沉淀中加入DNA提取液100μL混勻，沸水浴10min，13000 rpm離心5 min，上清液即為模板。

1.5.2LAMP引物設計：針對GenBank上公布的志賀菌 ipaH 基因序列中的保守區，用Primer 5.0設計2條外引物(F3、B3)和2條內引物(FIP、BIP)，見表1，均由上海科技有限公司合成。

表1 志賀菌LAMP法引物

1.5.3優化LAMP反應體系：建立初始反應體系，通過調整鎂離子、內外引物、甜菜堿濃度及反應時間、反應溫度，對志賀菌校準菌珠提取的標準模板，進行LAMP檢測，最終確定LAMP反應體系為25μL，包括：外引物F3、B3(10mmoL/L)各0.5μL，內引物FIP、BIP(10μmoL/L)各2μL；betaine(5mmoL/L)，2.5μL；BstDNA聚合酶(8U/L)，1μL；Bstbufer(10×)，2.5μL；dNTP(10mmoL/L)，2.5μL；MgCl2(2.5mmoL/L)，5μL；DNA模板，2μL；ddH2O4.5μL。反應條件為65℃恒溫1h，80℃滅活10min。肉眼直接觀察是否有白色沉淀產生，或添加熒光染料SYBR Green I 1μL，在紫外透射儀下觀察是否有綠色熒光反射，也可取5μL的產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測LAMP反應是否發生，從而判斷設計的LAMP擴增引物是否有效。

2 結 果

2.1臨床實際樣品檢測：分離培養方法為金標準，檢出志賀菌陽性90份，熒光定量PCR法與LAMP法均檢出志賀菌陽性105份，3種方法檢測結果的符合率為100%，LAMP靈敏度為100%，特異度為97.8%。比較3種方法的檢出率差異均無統計學意義(χ2=0.35，P>0.05)(見表2)。

表2 3種檢測方法檢出情況

圖1 志賀菌特異度實驗電泳結果

2.2LAMP法的特異度:使用建立的志賀菌LAMP檢測方法對福氏志賀菌、宋氏志賀菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單核細胞增生李斯特菌進行檢測，志賀菌屬有特征性梯狀條帶產生，最小DNA片段位于150bp處，檢測結果均為陽性，其余無條帶，擴增結果均為陰性，說明LAMP法具備良好的特異度(圖1)。

2.3LAMP法的靈敏度：將痢疾桿菌標準菌株接種于志賀氏菌增菌肉湯，經平板計數法得出此原始菌液濃度為4.7×108，將原始菌液10倍倍比稀釋，分別取各稀釋度菌液1mL，提取DNA模板，進行LAMP法和熒光PCR檢測。LAMP結果顯示當菌液濃度為4.7×101CFU/mL～4.7×108CFU/mL時，管底有白色沉淀產生，當菌液濃度低于4.7×101CFU/mL時，無沉淀產生。如在LAMP反應體系中加入SYBR Green I染料，反應完成后，在紫外燈下觀看顏色變化，呈現綠色熒光為陽性，橙色熒光為陰性，使結果觀察更加方便。熒光PCR結果表明當菌液濃度4.7×102CFU/mL～4.7×108CFU/mL時，有明顯S擴增曲線，當菌液濃度為低于4.7×102CFU/mL時，呈陰性反應。LAMP法敏感性高于熒光PCR法10倍。

3 討 論

志賀菌檢測是腸道門診檢測工作的主要項目，本研究建立的LAMP方法為志賀菌提供了很好的檢測方法，從DNA提取到實驗結束全過程只需1.5h，操作簡便、成本低廉，大大縮短了檢測時間，提高了檢測的效率。LAMP技術可在等溫條件下實現基因快速擴增，具有擴增反應快、靈敏度高、特異度強、不需要昂貴的儀器等優點，擴增產生的產物量大，形成白色的焦磷酸鎂鹽沉淀，因此肉眼也可進行結果判別[4]。

目前，國標中傳統的分離培養方法為檢測志賀菌的金標準，應用此方法，報告陽性病例并獲取到志賀氏菌株至少需要5d的時間，整個檢測過程易受人為主觀因素影響，且血清學分型鑒定試劑普便存在效價低、保質期短等缺點，常常導致假陰性造成漏檢。熒光PCR法雖然耗時短，但此方法必需特殊的儀器、嚴格的實驗環境和昂貴的試劑，不適用于基層檢測機構。而LAMP法擺脫了對儀器的依賴，操作簡單，具有更高的敏感性，更適合于基層實驗室。但LAMP法檢測的是志賀菌的通用核酸，檢測結果為陽性時，僅能說明標本中含有某種志賀菌，不能直接分離到菌株進行同源性分析。如果將LAMP法與傳統的分離培養法有效結合，先把標本用LAMP進行篩查，再將陽性標本用分離培養法進行檢測，必能大大也提高檢出率。LAMP方法僅適合作為分離培養方法的有益補充而不能代替它[5]。

LAMP技術，不需要特殊的儀器設備，在普通實驗室條件下即可實現[6,7]。LAMP方法的建立為腸道門診腹瀉病例志賀菌檢測及診斷提供了一種更快速、有效的實驗室檢測手段，具有較好的推廣應用前景[8]。

[1] Osorio JJ,Roman AR,Torre-Cisneros J.Spectrum and risk factors of invasive fungal infection[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2007,25(7):467～476.

[2] Peman J,Salaver M.General epidemiology of invasive fungal disease[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2012,30(2):90～98．

[3] Nucci M,Marr KA.Emerging fungal diseases[J].Clin Infect Dis,2005,41(4):521～526．

[4] Mayr A,Lass-Florl C.Epidemiology and antifungal resistance in invasive Aspergillosis according to primary disease ： review of the literature[J].Eur Med Res,2011,16(4):153～157.

[5] 溫來欣,方麗萍.應用LAMP同時快速檢測沙門菌和志賀菌的效果評價[J].職業與健康,2014,30(4):654～649.

[6] 焦文強,殷相平,柳紀省.環介導等溫擴增技術原理及其在檢測診斷病原微生物中的應用[J].生物技術通報,2009,18(9):54～57.

[7] 吳靜怡,董路寧,任立松,等.痢疾桿菌快速檢測方法的研究進展[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20(4):257～259.

TheApplicationofLAMPTechniqueinDetectionoftheBacillaryDysentery

WANGWei,etal

(ChengdeCentreforDiseasePreventionandControl,HebeiChengde067000,China)

Objective:To establish and apply the methods of LAMP assay for the detection of Shigella of infectious diarrhea patients from the enteric clinicsin.MethodsThe specific primers of the conserved regions of Shigella by using Primer Explorer V5 online and composed to establish the LAMP assay for detection of Salmonella. The 760 fecal specimens among diarrhea patients visiting the enteric clinicsin in Hospital of Chengde Medical College from 2016 was collected and test by Real-time PCR ,LAMP and the Traditional Method. The specificity and sensibility of LAMP were evaluated by comparing with Real-time PCR and the Traditional.ResultsThere was no statistical difference in the specificity of 3 method(P>0.05). LAMP showed fine specificity and high sensitivity.ConclusionLAMP assay was performed in water oven and the results could be directly determined by eyes under visible light or UV lamp. Because of its rapidity and minimal equipment requirement，LAMP assay for detection of Shigella in primary diseases control and prevention agency and primary health institutions.

Shigella; Real-time PCR; LAMP; Detection

1006-6233(2017)09-1496-03

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.09.026

河北省科技計劃項目，(編號：201701A012)

王海連