骨髓間充質干細胞及其在眼科疾病治療中的應用進展▲

葉 青 曾 靜

(1 湖北省中西醫結合醫院眼科，武漢市 430015，電子郵箱：gxykdxyq@126.com；2 廣西醫科大學第一附屬醫院眼科，南寧市 530000)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一種具有高度增殖能力、定向分化潛能及低免疫原性的成體干細胞，是理想的種子細胞來源，常被用于眼表損傷的修復，其顯著的抗炎性、免疫調節功能及神經營養功能又使其在多種視網膜疾病的治療中發揮重要作用。BMSC在眼科領域的研究日漸增多，為多種眼部疾病的治療提供了新方向。本文就BMSCs的生物學特性及在眼科領域的研究進展進行綜述。

1 BMSCs的生物學特性

1.1 生長特性及形態特征 1968年，Friedenstein等[1]發現在骨髓中除造血干細胞外還存在一種呈紡錘形、成纖維細胞樣的貼壁單核細胞，這種細胞參與調控造血干細胞的成熟并促進其進入外周循環系統。隨后Friedenstein等[1]體外培養發現，此種細胞可形成克隆集落單位，且具有潛在分化潛能，這種細胞即為BMSC。研究表明，間充質干細胞在骨髓中的分布極少，每104～105個骨髓細胞中僅約含1個BMSC。Deans等[2]發現，BMSC可傳至40代而分化能力無明顯變化，即按照其指數生長期的倍增時間(30～33 h)來算，增殖1億倍時其干細胞特性仍可保留。

1.2 分離純化 目前，BMSC的分離方法主要有密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細胞儀技術、磁珠分選技術，前兩種較常用于分離，后兩種多用于鑒定。(1)密度梯度離心法：骨髓中的紅細胞、白細胞、單核細胞的密度不同，用特定的淋巴細胞分離液將細胞離心、分層，收集單核細胞層，即為BMSC。常用的淋巴細胞分離液有Percoll和Ficoll兩種。目前此法最為常用，但是對離心速度有一定要求，過快易損傷細胞，過慢分層效果差、純度不高。(2)貼壁篩選法：骨髓中BMSC貼壁生長，其余紅細胞、白細胞及造血干細胞為懸浮生長，因此可使用骨髓沖洗液直接通過換液、傳代的方法篩選出BMSC。此法操作簡單，但需要不斷換液去除其他細胞，且因部分成纖維細胞也能貼壁生長，BMSC純度不高。(3)流式細胞儀技術：由于BMSC體積小、缺少表達標志物，雖可用流式細胞儀分選，但對細胞活性影響較大，且價格昂貴。(4)磁珠分選技術：將BMSC與含有單克隆抗體的免疫磁性微粒特異性結合形成磁珠-細胞復合體，利用磁場作用，將復合體吸附于磁場中，進而與其他細胞成分分離，但由于BMSC表面缺乏特異性標志物，因此分離效果欠佳。

1.3 鑒定 BMSC表面缺乏特異性標志物，因此大多通過形態特征、免疫表型、生長特點、分化能力等進行鑒定，也可通過排除法進行推斷，如實驗中使用流式細胞儀對BMSC進行鑒定的最低標準是(標準培養條件下)：能夠貼壁呈梭形生長，能夠表達CD29、CD44、CD90，不表達CD45、CD34、CD14或CD79α、CD11b、人類白細胞DR抗原等[4]。

1.4 表面標記 BMSC不僅表達間充質細胞的表面標記物，還兼具肌細胞、內皮細胞的表面特征。BMSC可表達多種表面標記物， 如黏附分子、生長因子、細胞因子、受體與整合素，但是迄今未發現獨特的BMSC表面標記物。當前已經研究成熟的BMSC陽性表達分子有CD44、纖維連接蛋白、CD90、CD29、CD105、CD13、CD133[5-9]。

1.5 誘導分化 研究表明，BMSC具有高度分化潛能，已被體外誘導為成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、內皮細胞、骨髓基質細胞以及神經元樣細胞等[10-12]。營養條件、細胞濃度、生長因子、組織因子都會影響BMSC的分化方向。BMSC既可向間充質組織細胞分化，也可向非間充質組織細胞分化，這一分化潛能為疾病治療提供了多種組織來源。在眼科研究領域，已將BMSC定向分化為上皮樣細胞[13-15]，作為種子細胞修復上皮損傷；或將BMSC分化為神經元、神經膠質細胞[16]或視網膜色素上皮細胞[17]等用于視網膜移植治療。

2 BMSC的治療機制

2.1 抗炎性 Thomas等[18]發現，與BMSC共同培養的自然殺傷細胞分泌干擾素的能力，是單獨培養的自然殺傷細胞的2.5～4倍，證實BMSC具有抗炎作用；Brandau等[19]發現，BMSC通過調節中性粒細胞的抗微生物免疫環境，抑制炎癥反應。

2.2 免疫調節性 Tomchuck等[20]發現，BMSC通過表達Toll受體，激活下游核因子κB、蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶信號，產生白細胞介素等細胞因子，促進免疫調節。

2.3 損傷修復性 Kim等[21]發現，BMSC不僅可以促進受損組織再生，還可促進受損的中樞及外周神經系統的功能恢復；Qu等[22]發現，BMSC可促進損傷的腸黏膜修復；Basiouny等[23]發現，BMSC促進表皮、真皮、毛囊的再生。

2.4 旁分泌功能 BMSC分泌神經保護因子和血管生成因子，如睫狀神經營養因子、堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、轉化生長因子β等[24]。

2.5 歸巢機制 歸巢是指在多種因素作用下，BMSC趨向性遷移至炎癥或損傷部位并定植的過程。Xiao等[25]給肝臟損傷的大鼠模型注射被標記的BMSC，發現趨化因子受體4與其配體基質細胞衍生因子1促使BMSC向損傷肝臟遷移。

3 BMSC與眼表疾病

3.1 BMSC與角膜損傷 角膜損傷時，具有修復能力的角膜緣干細胞缺失及角膜上皮的“結膜化”，誘發新生血管生成及炎癥反應，最終導致角膜瘢痕形成。傳統的治療方法主要有抗炎、促進角膜愈合、板層角膜移植、單純羊膜移植等，但供體來源有限且異體移植排異反應強烈。BMSC因其抗炎、抗新生血管生成、可定向分化為類角膜上皮的潛能及歸巢作用，逐漸被應用于角膜損傷的治療。

Oh等[26]局部應用BMSC治療堿燒傷動物模型，發現BMSC可分泌血小板反應蛋白1，同時降低VEGF和基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)的表達水平，從而抑制炎癥相關新生血管生成。Yao等[27]給堿燒傷大鼠模型結膜下注射BMSC，發現BMSC可通過旁分泌途徑抑制早期炎癥反應，并發揮其抗新生血管生成的作用。卞丹梅等[28]將BMSC種植于羊膜上，然后移植至堿燒傷大鼠角膜，發現BMSC可通過調節堿燒傷相關炎癥因子(白細胞介素2、白細胞介素10、轉化生長因子β、MMP-2、VEGF等)減輕炎癥反應。劉國華等[29]使用BMSC治療堿燒傷大鼠后，大鼠角膜新生血管及炎癥細胞均減少，大鼠眼表得以重建；吳利安等[30]發現，在角膜堿燒傷初期移植自體BMSC可減少多形核中性粒細胞浸潤，減輕角膜炎癥，下調或抑制MMP-2在受損角膜處的表達，并抑制基質膠原纖維的降解，從而減少堿燒傷后角膜潰瘍的發生。Roddy等[31]將BMSC通過靜脈或腹腔注射入堿燒傷大鼠體內后，其角膜渾濁程度和炎癥反應減輕，這一機制可能與堿燒傷后的角膜上皮細胞可激活BMSC分泌多能抗炎蛋白腫瘤壞死因子α，從而刺激多能抗炎蛋白腫瘤壞死因子α刺激基因6分泌有關。以上研究表明，BMSC有助于減輕損傷角膜的炎癥反應，促進修復。Lan等[32]給予熱損傷模型大鼠靜脈注射被標記的BMSC，72 h后在受損角膜中發現BMSC，而空白對照側眼角膜中并未檢測到BMSC，說明通過靜脈輸注的BMSC可被募集至角膜損傷部位。

3.2 BMSC與角膜移植 BMSC可作為種子細胞，與不同載體共同建立人工角膜用于角膜移植。目前常用的BMSC的載體主要為羊膜、脫細胞豬角膜基質及各種生物材料。Holan等[13]比較了BMSC和角膜緣干細胞在納米支架上的生長、分化和分泌特性，證實兩者對堿燒傷兔角膜具有相似的治療效果。Sun等[14]將眼發育相關的人配對盒基因6基因轉染大鼠間充質干細胞中，并移植到角膜緣干細胞缺陷(limbal stem cell deficiency，LSCD)兔模型，轉染后21 d，轉染的大鼠間充質干細胞表現出角膜樣上皮細胞的特征性石板樣外觀，并發現大鼠間充質干細胞可轉化為角膜樣上皮細胞。Rohaina等[15]利用角膜緣介質將BMSC誘導至角膜譜系。10 d后用于LSCD模型的治療，發現BMSC可被誘導成角膜上皮譜系，并在LSCD模型中重建角膜。

BMSC不僅可以分化為類角膜細胞，還可以抑制角膜移植后排斥反應，其機制可能與BMSC的免疫調節作用有關。Treacy等[33]發現，BMSC通過抑制外周免疫應答和調節移植物內免疫環境，來延長角膜移植物的存活時間。

4 BMSC與眼后段疾病

4.1 糖尿病視網膜病變 導致糖尿病可直接導致視網膜神經細胞、膠質細胞及小膠質細胞發生病理性改變，引起視網膜微血管病變，糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)主要表現為視網膜缺血缺氧和血管通透性增加。

Ritter等[34]認為，BMSC在缺血性損傷視網膜中可向損傷部位遷移并分化為內皮細胞、小膠質細胞及星形膠質細胞；Tomita等[35]發現，BMSC能夠分化為視網膜細胞和血管內皮細胞，從而保護光感受器細胞。利煥廉等[36]對DR大鼠模型行尾靜脈注射BMSC，發現密集的BMSC集中存在于視網膜外核層；且隨干預時間延長，大鼠血糖濃度逐漸下降，同時， 在視網膜中BMSC明顯向光感受器細胞及膠質細胞分化。這提示BMSC可降低DR大鼠血糖，在一定程度上修復血-視網膜屏障。劉凌[37]發現，對DR患者行靜脈注射BMSC后，房水及全身VEGF165水平下降，且VEGF165/VEGF165b比值下降，這提示BMSC可通過調節VEGF165/VEGF165b比例調控眼部新生血管相關因子的表達，抑制視網膜新生血管形成。?erman等[38]對糖尿病大鼠右眼靜脈注射綠色熒光蛋白標記的BMSC，發現BMSC主要整合到視網膜內并分化為膠質細胞，且振動電位波振幅明顯增加。而DR患者的視網膜電圖最常見的早期改變就是振動電位波振幅減小和隱形時間延長。Yang等[39]發現，BMSC可以通過分化成視網膜中的光感受器和膠質樣細胞，并通過降低血糖水平來改善糖尿病大鼠血-視網膜屏障的完整性；張杰等[40]將未分化的BMSC移植入糖尿病大鼠視網膜，發現部分BMSC可分化為視網膜細胞，雖然這些細胞不能精確表達神經樣蛋白，但可修復損傷并改善振動電位波b波。

4.2 早產兒視網膜病變 早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是由于早產兒和低體重兒抗氧化體系不全，高氧條件下視網膜微血管易受氧自由基損傷而導致的病變，其同時存在視網膜新生血管生成視網膜神經細胞的凋亡。

趙巖松等[41]將BMSC移植入ROP大鼠模型，發現BMSC可通過促進視網膜細胞中神經營養因子3和睫狀神經營養因子蛋白的表達，減少ROP大鼠視網膜細胞的凋亡。牟青杰等[42]將BMSC注射于氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)新生大鼠模型的玻璃體腔內，7 d后視網膜缺氧誘導因子1α和VEGF水平顯著降低，且視網膜大血管排列整齊，無灌注區明顯減少，這表明BMSC可通過抑制缺氧誘導因子1α及VEGF蛋白的表達來減少OIR新生大鼠視網膜新生血管的形成。此外，Wang等[43]將BMSC注射入OIR小鼠玻璃體腔內，發現小鼠新生血管區域及視網膜中央血管閉塞區域面積明顯減少。

4.3 視網膜變性性疾病 視網膜色素變性是一系列以感光細胞及色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)進行性功能喪失為共同表現的視網膜退行性疾病，致病原因多樣，目前尚無有效治療方法[44]。年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是隨年齡增長出現的雙側視網膜黃斑部進行性退行性病變，氧化應激引起視網膜功能紊亂及缺失在AMD中起重要作用[45]。視網膜色素變性和AMD均累及RPE和光感受器細胞。

趙雯等[46]將BMSC移植于大鼠視網膜下，光照24 h建立光感受器損傷模型，10 d后發現，與視網膜下注射生理鹽水相比，視網膜下注射BMSC可減少光感受器細胞凋亡。Peng等[47]發現BMSC可被誘導分化為RPE，表達RPE細胞表面標記物的同時具有吞噬感光細胞膜盤的功能。楊娟等[48]將GAP43基因轉染至BMSC后注射于大鼠視網膜下，30 d后發現視網膜厚度明顯增加且視紫紅質表達增多，說明GAP43基因修飾的BMSC移植能增加光感受器細胞存活率，延緩視網膜變性。Jian等[49]發現BMSC移植后可分泌神經因子調節Müller細胞功能，減少組織損傷。Wang等[50]將BMSC從尾靜脈注射至視網膜色素變性的大鼠模型體內，發現未經處理的對照組大鼠只剩一層光感受器細胞，而BMSC組大鼠的桿狀及錐狀光感受器均保留，且血管滲漏面積小，生長因子、神經營養因子較多。Arnhold[51]等將BMSC移植入敲除視紫紅質的小鼠體內，發現BMSC不僅融合至RPE及神經鞘層，還延長了光感受器存活時間。王寶英等[52]通過尾靜脈注射和玻璃體內注射的方式給視網膜色素變性模型小鼠移植BMSC，發現兩種方式均可修復損傷視網膜的形態結構，并能改善其電生理功能。Huo等[53]發現經視網膜下注射的BMSC可向視網膜感光細胞和RPE分化。

4.4 視網膜缺血再灌注損傷 視網膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)常見于青光眼、視網膜血管阻塞性疾病以及影響視網膜血流的手術術后患者中，由鈣超載及氧自由基連鎖反應引發細胞凋亡，其中凋亡相關因子(apoptosis-related factor,Fas)/Fas配體(Fas ligand，FASL)的膜受體死亡通路是其關鍵性調控因素。Rosenbaum等[54]發現在RIRI大鼠腦中Fas/FasL表達增高，同時神經元細胞的凋亡與Fas/FasL表達位置一致。曹永亮等[55]發現視網膜下移植BMSC可使RIRI大鼠視網膜中凋亡相關蛋白Caspase-3、Fas/FasL表達減少，進而減輕視網膜神經節的凋亡。

此外，Wang等[43]發現，在RIRI大鼠模型中，玻璃體腔內注射BMSC的大鼠視網膜厚于注射磷酸鹽緩沖液的大鼠視網膜。趙巖松等[56]證實視網膜下移植與玻璃體腔內移植BMSC均能顯著減輕RIRI，但經視網膜下移植的效果更為顯著。

4.5 青光眼 青光眼是視網膜的神經退行性病變，主要病理改變為神經節細胞丟失。BMSC可上調神經營養因子的生成及分泌，誘導損傷部位神經纖維再生；此外，BMSC還可分化為分泌更高水平腦源性神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子和VEGF的神經營養因子分泌間充質干細胞，從而保護視神經。Manuguerra-Gagné等[57]對激光誘導的開角型青光眼大鼠模型進行前房注射BMSC后，發現BMSC可通過旁分泌作用降低眼內壓、促進祖細胞池活化、誘導小梁網再生。Johnson等[58]證實局部應用BMSC對大鼠青光眼模型具有視神經保護作用，經玻璃體腔注射的BMSC使青光眼大鼠視神經軸突存活率提升了30%。Roubeix等[59]發現BMSC 經前房注射入青光眼樣高眼壓模型大鼠后，大鼠眼壓顯著降低，并推測其可能的機制如下：(1)BMSC通過激活抗凋亡途徑蛋白激酶B促進人小梁網細胞的存活；(2)人小梁網細胞隨著肌球蛋白磷酸化的降低而松弛；(3)人小梁網細胞不能轉化生長。

4.6 自身免疫性葡萄膜炎 自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis，EAU)發病機制復雜，多種炎癥因子參與其中，目前主要使用糖皮質激素及免疫抑制劑治療。而BMSC的免疫調節作用為EAU的治療提供了另一種可能。Oh等[60]通過給EAU小鼠模型腹腔注射BMSC，發現BMSC可通過抑制Th1/Th17，上調白細胞介素10，增加B220+CD19+細胞數量來抑制EAU發展。Lee等[61]給EAU小鼠模型靜脈輸注BMSC，發現BMSC通過趨化因子2依賴的方式將髓源性抑制細胞募集到炎癥部位，從而抑制EAU。

5 小 結

干細胞療法已成為眼科學領域新的研究方向，BMSC研究雖已經取得一定的進展，但仍存在一些問題尚待解決，例如隨個體年齡的增長，自身BMSC的分化潛能降低，如何解決自體移植受限；如何準確鑒定在體外分離、純化培養的BMSC；BMSC分化不定向，如何誘導其在體內定向分化；當BMSC作為移植物時其最佳移植數量、最佳移植時間、其免疫調節機制等。但是我們相信隨著科技的進步、檢測手段的更新以及科研工作者的共同努力，BMSC在眼科領域的研究和應用前景會更加廣闊。