廣西南部地區人群α地中海貧血基因攜帶情況及熱點突變檢測范圍探討▲

龍 駒

(1 廣西欽州市婦幼保健院，2 廣西欽州市地方病細胞與分子生物學重點實驗室，欽州市 535099，電子郵箱：lab@longju.net)

地中海貧血(地貧)是一種嚴重危害人類健康的單基因遺傳病。我國南方沿海地區人群中，地貧致病基因的攜帶率較高，其中廣西人群的地貧基因攜帶率最高[1]，高達25%[2]。地中海貧血的分子生物學機制為血紅蛋白珠蛋白基因簇的變異，在廣西人群中，導致α地貧的α珠蛋白基因簇變異在人群中的攜帶率高達17%[3]。由于重度α地貧會導致血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征，中間型α地貧會導致血紅蛋白H病，因此在廣西人群中，血紅蛋白Barts胎兒水腫綜合征的發生率或生育中間型α地貧基因型新生兒的概率較高，α地貧防控形勢較為嚴峻[4]。

目前，廣西已經建成由省-市-縣區防控機構組成的地貧三級防控體系。在各級地貧基因診斷機構中，廣泛使用的α地貧診斷試劑的檢測范圍為4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在前期的研究中，本課題組檢出了多種α地貧變異基因，其中-α21.9和-α2.4基因不在常規地貧檢測試劑檢測范圍中，但在廣西人群中的攜帶率較高[5]，這反映了以往對該區域人群α地貧基因研究的不足，應進一步分析該區域人群的α地貧基因頻率，并重新劃定納入常規地貧基因分析的基因型范圍，以免造成漏診。欽州市婦幼保健院在北部灣沿海城市醫療行業中處于中心位置，除了本市樣本外，還有大量來自防城港市和北海市(含市轄縣)的樣本在該院進行地貧基因檢測。因此，本研究采用同源片段相對定量法、片段分析法和常規地貧基因檢測試劑盒，分析2018～2019年欽州市婦幼保健院采集的樣本，以明確廣西南部(主要包括欽州市、防城港市、北海市)人群中α地貧基因的攜帶情況，并探討該區域常規α地貧基因檢測范圍以避免漏診。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 樣本來源于2018～2019年欽州市婦幼保健院采集的4 000例常規地貧基因檢測樣本，其中2 900例來源自戶籍為欽州市的個體，600例來源自戶籍為防城港市的個體，500例來源自戶籍為北海市的個體。所有受檢個體均簽署知情同意書。本研究已通過欽州市婦幼保健院倫理委員會審查。

1.2 試劑和儀器 常規地貧基因檢測試劑購自益生堂生物企業有限公司(批號：20190502)和亞能生物技術(深圳)有限公司(批號：A2019090006)，檢測范圍包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)、3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)，以及17種β地貧基因突變(βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654、βCD17、β-28、β-29、β-30、β-32、βCD26、βCD71-72、βCD43、βIVS-Ⅰ-1、β27/28、βInt M、βCD31、βCap+40-43、βCD14-15和βIVS-Ⅰ-5)。使用的檢測儀器包括3500基因分析儀(美國Life Technologies公司)、CFX96實時熒光分析系統(美國Bio-Rad公司)、Veriti GeneAmp PCR儀(美國Life Technologies公司)等。

1.3 檢測方法 常規地貧基因檢測試劑盒嚴格按照說明書使用流程完成操作。α基因拷貝數變異檢測采用本課題組自研的基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系[6]；其他罕見地貧基因采用本實驗室自研的定量熒光PCR體系和測序法完成[7]?；谕雌蜗鄬Χ糠ǖ亩縋CR檢測體系，其檢測目標為α1和α2基因拷貝數變異情況，并結合常規地貧基因檢測結果初步判斷是否存在罕見地貧基因變異，再采用多重連接探針擴增技術、裂口PCR、測序法等進行驗證；定量熒光PCR體系用于快速篩查本實驗室偶有檢出的熱點α地貧基因突變，陽性結果采用測序法進行驗證。

2 結 果

2.1 常規α地貧基因分析結果 在4 000例檢測樣本中，使用常規地貧基因檢測試劑盒共檢出1 713例α地貧基因陽性樣本，最主要的基因類型為缺失型地貧基因，其中以--SEA缺失最為常見。見表1。

表1 1 713例α地貧基因陽性樣本的基因型分布情況

2.2 罕見型基因篩查結果 采用同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系以及定量熒光PCR體系，共檢出17例提示存在罕見地貧基因但常規基因分析顯示正常的樣本。經測序、跨越斷點式PCR[1](即Gap-PCR)驗證后，這17例樣本的基因突變類型包括2.4缺失(-α2.4)、香港型(HKαα)、HBA2:c.91_93delGAG、HBA2:c.91G>C、欽州型缺失(-α21.9)、融合基因(Fusion)，見表2。融合基因測序結果見圖1[8]。

表2 17例罕見型α地貧基因陽性樣本的基因型

圖1 融合基因(Fusion)的測序結果圖

2.3 綜合分析結果 在4 000例檢測樣本中，采用常規基因檢測試劑檢出1 713例陽性樣本，采用輔助方法篩查出17例陽性樣本，其中1例常規基因檢測結果為--SEA/αα的樣本確認攜帶有-α2.4基因，實際陽性樣本應為1 729例。1 729例陽性樣本共包含1 833個α地貧突變(部分為α地貧雙重雜合子)，最常見的3種類型依次為--SEA、-α3.7和-α4.2，其余罕見地貧基因偶有檢出，見表3。

表3 1 833個α地貧突變的類型

3 討 論

目前，在廣西地貧三級防控體系中，地貧基因檢測實驗室所使用的通用檢測試劑盒檢測范圍一般包括4種缺失型α地貧基因(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和3種非缺失型α地貧基因突變(αCSα、αQSα和αWestmeadα)。在廣西人群中，偶有研究組報告檢出罕見地貧基因，而這些基因大部分是由于血液學數據與基因型數據不匹配，進而采用進一步的檢測手段所測出的[8-10]。

本課題組構建了基于同源片段相對定量法的定量PCR檢測體系，該體系選擇目標序列的原則為尋找序列中的同源片段，確保同源片段的兩端有共同的可以用于構建PCR體系引物端的序列，根據分子生物學序列特征構建探針或者采用單側熒光標記體系，使用熱啟動酶的PCR體系進行優化，優化至理論結果與實際檢測結果大致吻合為止。本研究采用常規地貧基因檢測試劑盒以及自研檢測體系，對4 000例樣本進行α地貧基因的檢測，結果顯示，該人群攜帶的主要α地貧基因或基因突變類型為--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα，但依然檢測出罕見地貧基因突變，包括-α2.4、--THAI、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)。在以往的研究中[5，8]，我們多次檢出了基因型為--SEA/-α2.4和--SEA/-α21.9的血紅蛋白H病患者，也檢出了多例攜帶HKαα或--THAI基因的個體。這反映了以上4種基因的重要性。在日常地貧篩查中，血常規檢測儀器的準確性是影響地貧篩查結果準確性的重要因素，但部分個體接受地貧基因檢測時甚至沒有進行血常規檢測而直接進行常規地貧基因分析。未提供受測者的血常規數據、血常規檢測數據不準，或者靜止型地貧對血常規的影響較小，是導致這些α地貧基因漏檢的重要因素。

在α地貧基因分析中，--SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα作為主要α地貧基因的檢測范圍已經沿用了十幾年。近5年來，廣西質量控制機構意識到--THAI基因的重要性，要求防控機構將該基因納入檢測范圍。因此，廣西的主流地貧基因檢測實驗室的α地貧基因檢測范圍大多數為--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2、αCSα、αWestmeadα和αQSα。而最近有研究揭示了-α2.4、HKαα、-α21.9和融合基因(Fusion)在該區域地貧基因檢測中的重要性[5，8，11]，因而檢測機構應根據自身實際情況逐步將這些基因納入常規基因檢測范圍內，尤其是-α2.4和-α21.9應納入必檢范圍，避免這些重要基因的漏檢。