利用iTRAQ技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組篩選芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交不親和基因

賀丹,謝棟博,張佼蕊,何松林,李朝梅，鄭云冰,王政，劉藝平，栗燕,逯久幸

利用iTRAQ技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組篩選芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交不親和基因

賀丹1,2,謝棟博1,張佼蕊1,何松林1,2,李朝梅1，鄭云冰1,王政1，劉藝平1，栗燕1,逯久幸1

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002；2河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

【目的】遠(yuǎn)緣雜交育種是目前牡丹、芍藥品種改良和育種的主要方法，而遠(yuǎn)緣雜交不親和一直是制約其快速發(fā)展的主要因素。本研究從牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交授粉后不親和應(yīng)答相關(guān)的柱頭差異蛋白與轉(zhuǎn)錄組方面深入研究，揭示牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交不親和的分子機(jī)理，為雜交育種提供理論依據(jù)。【方法】以芍藥‘粉玉奴’自交、芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交為供試材料，在授粉后24 h采取柱頭，分別進(jìn)行同位素標(biāo)記相對(duì)定量（iTRAQ）和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析。對(duì)所獲得的蛋白和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)其中可能與遠(yuǎn)緣雜交不親和相關(guān)的基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。【結(jié)果】利用iTRAQ技術(shù)分析牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交后柱頭中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，共鑒定到685個(gè)差異蛋白，富集到了188條通路，其中顯著富集的Pathway有18條。與不親和授粉相關(guān)代謝通路有RNA降解、鈣信號(hào)途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase signaling pathway，MAPK）信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)。在RNA降解代謝通路中，烯醇酶（Enolase）、熱休克蛋白DnaK（HSP70）及病菌抗原（GroEL）均表達(dá)下調(diào)。在鈣信號(hào)途徑中，鈣調(diào)蛋白（CALM）表達(dá)下調(diào)，腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶（adenine nucleotide translocase，ANT）表達(dá)量增加，表達(dá)上調(diào)。MAPK信號(hào)途徑中，乙二醛酶Ⅰ（GloI）表達(dá)下調(diào)。磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)中的鈣調(diào)蛋白（CALM）表達(dá)下調(diào)。隨機(jī)選取與差異蛋白相關(guān)的6個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，6個(gè)基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平趨勢(shì)相一致，均表達(dá)下調(diào)。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得了52 998個(gè)有注釋信息的Unigene，占所有Unigene的40.37%。基于6組樣品的RPKM（Reads Per Kilobase per Million）值，共篩選到16 224個(gè)差異基因。其中上調(diào)基因13 361，下調(diào)基因2 863個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行pathway顯著富集分析，雜交與自交相比，不親和差異表達(dá)的基因主要富集在氧化磷酸化代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、次級(jí)代謝產(chǎn)物等通路。與遠(yuǎn)緣雜交不親和相關(guān)且發(fā)生顯著變化的基因有、（胼胝質(zhì)酶）和（squamosapromoter binding protein-like）表達(dá)上調(diào)，（ABC transporter family protein）表達(dá)下調(diào)。【結(jié)論】在轉(zhuǎn)錄組和蛋白數(shù)據(jù)共注釋到6個(gè)蛋白、4個(gè)基因與植物不親和性密切相關(guān)，這些蛋白與基因可能在遠(yuǎn)緣雜交不親和方面發(fā)揮著重要作用。

牡丹；芍藥；iTRAQ；轉(zhuǎn)錄組；遠(yuǎn)緣雜交

0 引言

【研究意義】牡丹（）是芍藥科芍藥屬的落葉亞灌木，迄今已有1 600多年的栽培歷史，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，也是我國(guó)特有的名貴觀賞兼藥用植物[1]。芍藥科芍藥屬的牡丹與芍藥，被譽(yù)為“花王和花相”，具有很高的觀賞和生產(chǎn)價(jià)值。牡丹、芍藥的新品種培育工作一直是科研和生產(chǎn)的重要內(nèi)容。雜交育種作為傳統(tǒng)的育種方式，也是牡丹、芍藥的主要育種方法。利用雜交育種能夠培育出一些具有較高觀賞價(jià)值、抗寒、抗病等特點(diǎn)的新品種，而芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交在國(guó)內(nèi)的研究還處于初步階段[2-3]。通過一系列研究發(fā)現(xiàn)受精前障礙是牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交育種過程中存在的嚴(yán)重問題。在雜交過程中，雖然少量花粉能在柱頭上萌發(fā)并穿過柱頭，但花粉管的伸長(zhǎng)卻受到阻礙，并且在柱頭上產(chǎn)生了大量的胼胝質(zhì)，從而阻礙花粉管進(jìn)入子房完成受精[4-5]。通過研究牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交不親和性的機(jī)制，對(duì)克服遠(yuǎn)緣雜交受精前障礙，實(shí)現(xiàn)牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)篩選相關(guān)基因能夠提高育種效率，克服常規(guī)育種中的困難[6-9]。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是2004年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）推出的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。其可靠的結(jié)果已經(jīng)廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，包括尋找功能蛋白，篩選生物標(biāo)志物或特殊蛋白，研究抗逆機(jī)理等[10]。程云清等[11]以平歐雜交榛‘達(dá)維’的正常發(fā)育與敗育子房為材料，進(jìn)行蛋白樣品技術(shù)分析，初步篩選獲得可能參與調(diào)控榛子子房敗育的候選蛋白37個(gè)。目前，有關(guān)iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于植物雜交不親和性的研究鮮少報(bào)道。Chalivendra等[12]采用iTRAQ技術(shù)研究番茄的種間生殖障礙，通過對(duì)蛋白質(zhì)組變化的分析發(fā)現(xiàn)花粉-柱頭互作中的蛋白包括S-RNases、HT-A蛋白、細(xì)胞壁疏松以及抗性響應(yīng)相關(guān)蛋白。LI等[13]使用iTRAQ技術(shù)揭示了大米花粉-柱頭互作的蛋白機(jī)制，發(fā)現(xiàn)泛素化在授粉的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用。利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以挖掘重要的功能基因，揭示優(yōu)良性狀的分子機(jī)制，還可以研究不同器官、不同環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的差異。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蠟梅、油松、油桐等的研究中[14-16]。ZHOU等[17]對(duì)羊草成熟花柱、子房、葉片高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)多達(dá)1 025個(gè)轉(zhuǎn)錄本在花柱中特異性表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄本集中在細(xì)胞間交流與信號(hào)傳導(dǎo)。【本研究切入點(diǎn)】目前，中外學(xué)者探討了一些植物育種中的不親和機(jī)理，但關(guān)于牡丹、芍藥遠(yuǎn)緣雜交不親和機(jī)理的研究還很欠缺。本研究在前期芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)芍藥自交與芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交親和性存在顯著差異。【擬解決的關(guān)鍵問題】以芍藥‘粉玉奴’自交、芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交授粉后24 h的柱頭為供試材料，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和iTRAQ分析及后續(xù)分析，以期從中篩選出與雜交不親和性相關(guān)的基因及蛋白，揭示芍藥屬遠(yuǎn)緣雜交不親和性分子機(jī)制，為芍藥遠(yuǎn)緣雜交育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試母本芍藥品種‘粉玉奴’與父本牡丹品種‘鳳丹白’均引自山東菏澤，于2011年栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃基地，植株生長(zhǎng)良好，可以正常開花結(jié)實(shí)。于2018年4月初采取‘鳳丹白’花粉，進(jìn)行生活力測(cè)定后，儲(chǔ)存于4℃冰箱。4月中下旬進(jìn)行雜交，自交組合為‘粉玉奴’ב粉玉奴’，雜交組合為‘粉玉奴’ב鳳丹白’。依據(jù)前期熒光顯微觀察確定雜交障礙發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)間，授粉后24 h取自交與雜交的柱頭用液氮速凍并置于-80℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 iTRAQ標(biāo)記

采用丙酮沉淀法提取自交與雜交組柱頭的蛋白質(zhì)。對(duì)提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后將樣品取等量蛋白Trypsin酶解，用iTRAQ 113、114標(biāo)記未經(jīng)授粉的柱頭中的蛋白，iTRAQ 115、116標(biāo)記雜交授粉后柱頭中的蛋白，TRAQ 117、118標(biāo)記自交授粉后柱頭中的蛋白，最后將標(biāo)記好的樣品分別等量混合，應(yīng)用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（strong cation ex- change chromatography，cx）方法對(duì)混合后的肽段進(jìn)行預(yù)分離，隨后再進(jìn)行液相分離和質(zhì)譜分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

采用天根生物公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取RNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120 V電泳20 min。取1 μL RNA樣品，采用Thermo公司生產(chǎn)的Nano Drop ND-5000型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的A260/A230和A260/A280的比值及RNA濃度，進(jìn)行RNA的濃度和質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)符合建庫(kù)要求的RNA送至武漢華大進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用BGISEQ-500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先，計(jì)算各個(gè)重復(fù)樣品相對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)定量值的中位數(shù)作為待比較樣品的定量值，并據(jù)此計(jì)算待比較樣品間蛋白的最終差異倍數(shù)。其次，利用待比較樣品間所有重復(fù)樣品每個(gè)蛋白質(zhì)的定量值進(jìn)行T-檢驗(yàn)，計(jì)算出-value，并利用Benjamini-Hochberg多重假設(shè)檢驗(yàn)的方法校正值，得到校正后的值-value。最后根據(jù)差異倍數(shù)和-value來篩選出差異蛋白，當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍及以上（即up regulate≥1.5和down regulate≤0.67），且經(jīng)過顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其-value值≤0.05時(shí)，將其作為顯著差異蛋白。

使用DEGseq軟件對(duì)樣品間進(jìn)行差異表達(dá)分析，條件為Fold Change≥2且Adjustedvalue≤0.001，將-value矯正為-value。為了提高DEGs的準(zhǔn)確性，定義差異倍數(shù)為兩倍以上并且-value≤0.001的基因，篩選為顯著差異表達(dá)基因。

1.5 定量PCR驗(yàn)證

使用TRIzol法對(duì)各樣品進(jìn)行總RNA提取，用ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）進(jìn)行cDNA的合成。以cDNA為模板，選擇作為內(nèi)參基因[18]，檢測(cè)引物為F：5′-TGAGCACCAAAGAAGTGGACGAAC-3′和R：5′-CACACGCCTGAACATCTCCTGAA-3′。使用SYBR Premix Ex TaqTMkit試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）在ABI PRISM 7900HT Real-Time PCR System（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司）上進(jìn)行qPCR檢測(cè)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。20 μL反應(yīng)體系包括10 μL SYBR?Premix，1 μL cDNA，正、反引物各取0.5 μL，ddH2O 8 μL。兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，60 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，按照2-△△CT法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5，基因及檢測(cè)引物等相關(guān)信息詳見表1。

2 結(jié)果

2.1 iTRAQ分析得到的與雜交不親和相關(guān)蛋白代謝通路

通過對(duì)雜交不親和、自交親和授粉后的芍藥雌蕊柱頭差異蛋白進(jìn)行Pathway富集分析，將 685個(gè)差異蛋白富集到188條通路，其中顯著富集的Pathway有18條。通過分析，鑒定到與不親和授粉相關(guān)的代謝通路有RNA降解（RNA degradation）、鈣信號(hào)途徑（Calcium signaling pathway）、促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)途徑MAPK及磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)（Phosphatidylinositol signaling system）4個(gè)通路。4個(gè)通路中注釋到的差異蛋白共有28個(gè)（表2）。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證所選基因及對(duì)應(yīng)引物信息

表2 遠(yuǎn)緣雜交不親和相關(guān)的的差異蛋白通路

2.2 與遠(yuǎn)緣雜交不親和相關(guān)的差異蛋白

在28個(gè)差異蛋白中，與不親和相關(guān)的差異蛋白有6個(gè)。在RNA降解代謝通路中，以親和授粉的雌蕊柱頭蛋白為對(duì)照，烯醇酶（Enolase）、熱休克蛋白DnaK（HSP70）及病菌抗原（GroEL）均表達(dá)下調(diào)。在鈣信號(hào)途徑中，鈣調(diào)蛋白（CALM）表達(dá)下調(diào)，鈣信號(hào)途徑受到影響。當(dāng)植物處于逆境脅迫時(shí)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶（ANT）表達(dá)量增加，表達(dá)上調(diào)。磷酸肌醇信號(hào)途徑通過參與細(xì)胞外鈣調(diào)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的啟動(dòng)。磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)中的鈣調(diào)蛋白（CALM）表達(dá)下調(diào)。MAPK信號(hào)途徑參與調(diào)控磷酸肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Ca2+信號(hào)途徑等，也參與了IAA/ABA的代謝信號(hào)途徑。乙二醛酶Ⅰ（GloI）是一種能夠提高植物抗性的蛋白，該途徑中的乙二醛酶Ⅰ（GloI）表達(dá)下調(diào)（表3）。

表3 與遠(yuǎn)緣雜交不親和相關(guān)的差異蛋白

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析得到的與授粉不親和相關(guān)的基因

2.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的功能注釋 為了了解雜交親和性的基因表達(dá)情況，將測(cè)序的Unigene進(jìn)行功能注釋。通過選擇BLAST參數(shù)E-value不大于1e-5和HMMER參數(shù)E-value不大于1e-10，與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后最終獲得52 998個(gè)有注釋信息的Unigene，占所有Unigene的40.37%。其中45 943條被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，35 181條被注釋到NT數(shù)據(jù)庫(kù)，33 186條被注釋到Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)，33 828條被注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，34 854條被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，35 864條被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)，被注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的有24 594條。

2.3.2 差異基因分析 基于6組樣品的RPKM值，共篩選到16 224個(gè)差異基因。其中上調(diào)基因13 361，下調(diào)基因2 863個(gè)。通過KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的基因涉及多種生物學(xué)途徑，將基因參與的KEGG代謝通路分為5大類：細(xì)胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabolism）、有機(jī)系統(tǒng)（Organismal Systems）。雜交柱頭與自交柱頭相比，不親和差異表達(dá)的基因主要富集在氧化磷酸化代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、次級(jí)代謝產(chǎn)物等通路。

在KEGG分析中胼胝質(zhì)酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑是植物花粉發(fā)育，受精的重要途徑[19-20]，結(jié)合相關(guān)研究，從以上顯著富集的差異表達(dá)基因集中篩選得到4個(gè)可能與雜交不親和相關(guān)的基因（表4）。CL268_All、Unigene36776_All和CL7449_All在不親和相對(duì)于親和基因中顯著表達(dá)上調(diào)。CL8637_All在不親和相對(duì)于親和基因中顯著表達(dá)下調(diào)。

表4 不親和相關(guān)的差異基因

2.3.3 相關(guān)差異基因的Blast比對(duì)分析 通過BLAST軟件將CL268_All編碼的氨基酸序列與其他物種對(duì)比篩選同源序列（圖1），發(fā)現(xiàn)該基因與葡萄（）（82.70%)、茶（）（82.42%）、栓皮櫟（）（81.76%）、核桃（）（81.21%）、桃（）（80.87%）的相似度較高。

通過BLAST軟件將Unigene36776_All編碼的氨基酸序列與其他物種對(duì)比篩選同源序列（圖2），發(fā)現(xiàn)該基因與茶（）（81.56%）、葡萄（）（80.69%）、櫻桃（）（80.53%）、桃（）（80.75%）、核桃（）（80.10%）的相似度較高。

通過BLAST軟件將CL8637_All編碼的氨基酸序列與其他物種對(duì)比篩選同源序列（圖3），發(fā)現(xiàn)該基因與哥倫比亞錦葵（）（82.66%）、橡膠樹（）（83.05%）、核桃（）（82.76%）、栓皮櫟（）（83.84%）、棗（）（82.95%）的相似度較高。

圖1 CL268_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對(duì)比

通過BLAST軟件將CL7449_All編碼的氨基酸序列與其他物種對(duì)比篩選同源序列（圖4），發(fā)現(xiàn)該基因與光皮樺（）（73.74%）、榴蓮（）（76.78%）、麻風(fēng)樹（）（73.74%）、核桃（）（74.78%）、胡楊（）（73.54%）的相似度較高。

2.4 差異表達(dá)蛋白相關(guān)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證差異蛋白結(jié)果，隨機(jī)選取gi|327424468_1（烯醇酶）、gi|327436891_2（熱休克蛋白）、gi|327427673_4（熱休克蛋白）、gi|327426876_5（病菌抗原）、gi|327427197_1（鈣調(diào)蛋白）、gi|327433480_5（乙二醛酶Ⅰ）等差異蛋白對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5。6個(gè)差異蛋白所對(duì)應(yīng)基因在自交與雜交時(shí)期芍藥雌蕊柱頭中表達(dá)量和變化趨勢(shì)有顯著差異，表明這些基因在牡丹、芍藥雜交過程中的表達(dá)具有明顯的空間特異性。定量PCR結(jié)果與蛋白質(zhì)水平趨勢(shì)相一致，均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。

3 討論

遠(yuǎn)緣雜交后芍藥柱頭中的差異蛋白及差異基因參與較多的通路中也包括RNA降解。在RNA降解代謝通路中，以親和授粉的雌蕊柱頭為對(duì)照，烯醇酶、熱休克蛋白、病菌抗原均下調(diào)表達(dá)，其中烯醇酶參與了花粉-柱頭相互作用。SHEORAN等[21]在油菜的研究中發(fā)現(xiàn)烯醇酶參與了花粉-柱頭相互作用，親和授粉后，烯醇酶在萌發(fā)的花粉中上調(diào)表達(dá)。陶璐與岳訓(xùn)[22]在擬南芥花粉管與柱頭的互作研究中發(fā)現(xiàn)花粉管的延長(zhǎng)觸發(fā)了柱頭組織中的糖酵解途徑，激活了糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽，而丙酮酸鹽進(jìn)一步代謝為被花粉管吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在丙酮酸鹽代謝的過程中，烯醇酶作為關(guān)鍵性的酶參與了丙酮酸鹽的轉(zhuǎn)化。因此，烯醇酶與花粉生長(zhǎng)及授粉的親和性密切相關(guān)。熱休克蛋白是防御類蛋白質(zhì)，與其他分子物質(zhì)合作，穩(wěn)定先前存在的蛋白質(zhì)以抵抗聚集并介導(dǎo)細(xì)胞溶質(zhì)中以及細(xì)胞器內(nèi)新翻譯的多肽折疊，結(jié)合延伸的肽片段，具有損傷后應(yīng)激誘導(dǎo)的作用[23]。花粉萌發(fā)穿過柱頭可以看作是一種外來物質(zhì)入侵植物的行為，會(huì)引發(fā)植物的防御系統(tǒng)，促進(jìn)防御類蛋白的產(chǎn)生或者上調(diào)表達(dá)。而在本研究中，熱休克蛋白下調(diào)表達(dá)，其原因有待進(jìn)一步研究。

圖3 CL8637_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對(duì)比

圖4 CL7449_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對(duì)比

圖5 JI445505、JI457928、JI448710、JI447913、JI448234和JI454517等6個(gè)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

花粉管極性生長(zhǎng)受多種信號(hào)和代謝途徑調(diào)控，包括MAPK信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)通路等[24]。磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)參與花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)，磷酸肌醇途徑受到抑制之后，會(huì)擾亂花粉管頂端Ca2+濃度梯度的產(chǎn)生和維持，還導(dǎo)致胼胝質(zhì)在頂端的大量沉積[25]。本研究中，牡丹、芍藥不親和授粉后磷脂酰肌醇信號(hào)途徑中的鈣調(diào)蛋白下調(diào)表達(dá)，磷脂酰肌醇途徑受到了抑制，從而花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)受到了限制。MAPK信號(hào)途徑中蛋白激酶活性降低抑制花粉管生長(zhǎng)，反之則促進(jìn)[26]。LI等[27]將不親和的花粉用MAPK抑制劑處理后，花粉恢復(fù)活性，驗(yàn)證了MAPK介導(dǎo)花粉失活的假設(shè)。乙二醛酶系統(tǒng)存在于植物的葉、花等部位[28]，甲基乙二醛（MG）是高等植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種細(xì)胞毒素代謝物，而乙二醛酶Ⅰ（GloI）主要維持甲基乙二醛（MG）的動(dòng)態(tài)平衡，清除過多的MG[28-29]。本研究中，MAPK信號(hào)途徑中的乙二醛酶Ⅰ（GloI）下調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致MG過多，從而引起花粉的死亡。

腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶（adenine nucleotide translocator，ANT）作為ADP/ATP載體，催化ADP和ATP在線粒體內(nèi)膜上的交換，為生物機(jī)體提供能量[30]。當(dāng)植物處于逆境脅迫時(shí)，ANT表達(dá)量減少，在本研究中腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶ANT表達(dá)下調(diào)可能是對(duì)花粉管穿入柱頭的抗逆表達(dá)。胼胝質(zhì)的合成與降解是一個(gè)嚴(yán)密的調(diào)控過程，受GSL酶的直接調(diào)控，與在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中涉及胼胝質(zhì)酶合成通路，參與葡聚糖催化合成路徑，并作為細(xì)胞膜的組成部分。其中在減數(shù)分裂后期發(fā)揮調(diào)控作用，不親和植株中由其催化合成的胼胝質(zhì)大量增多，最終導(dǎo)致植株育性降低；則主要參與胞間分子運(yùn)動(dòng)和抗逆反應(yīng)[19]。

目前研究中發(fā)現(xiàn)S-Rnase介導(dǎo)自交不親和，S-Rnase由花柱進(jìn)入花粉管產(chǎn)生細(xì)胞毒性阻礙花粉管生長(zhǎng)。自我S-Rnase能降解花粉管內(nèi)RNA，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，引起花粉管發(fā)生細(xì)胞程序性死亡[31-32]。在蘋果中花柱S-Rnase與花粉MdABCF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)Tran結(jié)合，以內(nèi)吞的方式進(jìn)入膜內(nèi)，運(yùn)輸至花粉管液泡中，積累到一定量后，被釋放進(jìn)入花粉管胞質(zhì)引起花粉管生長(zhǎng)停滯，最終引起自交不親和反應(yīng)[33]。MdABCF能夠非選擇性的運(yùn)送S-Rnase至花粉管內(nèi)。在植物大、小孢子發(fā)生以及雌、雄配子體發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。主要是與花粉囊發(fā)育及花藥開裂相關(guān)[20]。本研究中上調(diào)表達(dá)，而花粉囊發(fā)育及花藥開裂在本研究中均不存在問題，推測(cè)可能與花粉的進(jìn)一步發(fā)育有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究闡述了牡丹與芍藥雜交不親和性的分子機(jī)制，通過iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)與遠(yuǎn)緣雜交不親和性相關(guān)的代謝通路主要集中在RNA降解、MAPK信號(hào)途徑、鈣信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)4個(gè)途徑。轉(zhuǎn)錄組的差異基因則主要是胼胝質(zhì)合成酶（家族）、及相關(guān)基因。

[1] 文書生, 何絨絨, 鄭家康, 田如男. 牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展. 林業(yè)科學(xué), 2018, 54(10): 143-155.

WEN S S, HE R R, ZHENG J K, TIAN R N. Research advances in tissue culture of tree peony., 2018, 54(10): 143-155. (in Chinese)

[2] 景士西. 園藝植物育種學(xué)總論. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 144-173.

JING S X..Beijing: China Agriculture Press, 2000: 144-173. (in Chinese)

[3] 賀丹, 解夢(mèng)珺, 呂博雅, 王政, 劉藝平, 何松林. 牡丹與芍藥的授粉親和性表現(xiàn)及其生理機(jī)制分析. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 46(10): 129-1360.

HE D, XIE M J, LV B Y, WANG Z, LIU Y P, HE S L. Analysis of pollination affinity performance and its physiological mechanism inand., 2017, 46(10): 129-136. (in Chinese)

[4] 何桂梅, 成仿云. 牡丹的雜交育種及其最新進(jìn)展//中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展. 北京: 中國(guó)林業(yè)出版社, 2004: 149-155.

HE G M, CHENG F Y. Crossbreeding ofand its latest progress//Beijing: China Forestry Press, 2004: 149-155. (in Chinese)

[5] 賀丹, 王雪玲, 高小峰, 呂博雅, 劉藝平, 何松林. 牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜交親和性. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 42(7): 65-68.

HE D, WANG X L, GAO X F, LV B Y, LIU Y P, HE S L. Intergeneric cross-compatibility between peonies., 2014, 42(7): 65-68. (in Chinese)

[6] 張振乾, 肖鋼, 春云, 鄔賢夢(mèng), 熊興華, 李云昌, 胡瓊, 陳社員.利用轉(zhuǎn)錄組及iTRAQ技術(shù)篩選高油酸油菜抗病相關(guān)基因. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(5): 16-24.

ZHANG Z Q, XIAO G, CHUN Y, WU X M, XIONG X H, LI Y C, HU Q, CHEN S Y. The study of high oleic acid rapeseed disease resistance related genes by transcriptome and iTRAQ analysis., 2015, 30(5): 16-24. (in Chinese)

[7] 汪寶卿, 解備濤, 張海燕, 董順旭, 段文學(xué), 王慶美, 張立明. 基于iTRAQ技術(shù)的不同耐旱性甘薯苗期根系差異蛋白分析. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2017, 31(10): 1904-1912.

WANG B Q, XIE B T, ZHANG H Y, DONG S X, DUAN W X, WANG Q M, ZHANG L M. Analysis of differential proteome in roots during seedling stage of sweetpotato with different drought tolerance based on iTRAQ method., 2017, 31(10): 1904-1912. (in Chinese)

[8] 于濤, 李耕, 劉鵬, 董樹亭, 張吉旺, 趙斌. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示玉米籽粒發(fā)育過程中脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)特性. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(11): 2114-2128.

YU T, LI G, LIU P, DONG S T, ZHANG J W, ZHAO B. Proteomic analysis of maize reveals expression characteristics of stress-related proteins during grain development., 2017, 50(11): 2114-2128. (in Chinese)

[9] 趙振利, 童琳琳, 鄧敏捷, 董焱鵬, 范國(guó)強(qiáng). 泡桐叢枝病發(fā)生過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(4): 23-28.

ZHAO Z L, TONG L L, DENG M J, DONG Y P, FAN G Q. Proteomic study on the occurrence ofwitches broom disease., 2018, 38(4): 23-28. (in Chinese)

[10] 謝秀枝, 王欣, 劉麗華, 董世雷, 皮雄娥, 劉偉. iTRAQ技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2011, 20(7): 616-621.

XIE X Z, WANG X, LIU L H, DONG S L, PI X E, LIU W. iTRAQ technology and its application in proteomics., 2011, 20(7): 616-621. (in Chinese)

[11] 程云清, 齊名, 趙永斌, 邢繼洋, 劉劍鋒. 榛子正常發(fā)育與敗育子房差異蛋白譜對(duì)比分析. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 40(3): 13-25.

CHENG Y Q, QI M, ZHAO Y B, XING J Y, LIU J F. Comparative studies on differently expressed proteomes of developing and abortive ovary in hazelnut., 2018, 40(3): 13-25. (in Chinese)

[12] CHALIVENDRA S C, LOPEZ-CASADO G, KUMAR A, KASSENBROCK A R, ROYER S, TOVAR-MèNDEZ A, COVEY P A, DEMPSEY L A, RANDLE A M, STACK S M, ROSE J K C, MCCLURE B, BEDINGER P A. Developmental onset of reproductive barriers and associated proteome changes in stigma/styles of., 2013, 64(1): 265-279.

[13] LI M, WANG K, LI S Q, YANG P F. Exploration of rice pistil responses during early post-pollination through a combined proteomic and transcriptomic analysis., 2016, 131: 214-226.

[14] 楊楠, 趙凱歌, 陳龍清. 蠟梅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及次生代謝產(chǎn)物合成途徑研究. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(1): 104-107.

YANG N, ZHAO K G, CHEN L Q. Deep sequencing-based transcriptome profiling analysis ofreveals insights into secondary metabolites biosynthesis., 2012, 34(1): 104-107. (in Chinese)

[15] 鈕世輝, 袁虎威, 陳曉陽(yáng), 李偉. 油松雌雄球花高通量基因表達(dá)譜芯片分析. 林業(yè)科學(xué), 2013, 49(9): 46-51.

NIU S H, YUAN H W, CHEN X Y, LI W. Microarray analysis of large scale gene expression profiles between male and female cones of., 2013, 49(9): 46-51. (in Chinese)

[16] 孫穎, 譚曉風(fēng), 羅敏, 李建安. 油桐花芽2個(gè)不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組分析. 林業(yè)科學(xué), 2014, 50(5): 70-74.

SUN Y, TAN X F, LUO M, LI J A. The sequencing analysis of transcriptome offlower buds at two development stages., 2014, 50(5): 70-74. (in Chinese)

[17] ZHOU Q Y, JIA J T, HUANG X, YAN X Q, CHENG L Q, CHEN Y, LI X X, NG A J, LIU G S. The large-scale investigation of gene expression instigmas provides a valuable resource for understanding the mechanisms of poaceae self-incompatibility., 2014, 15(1): 399.

[18] 賀丹, 李睿, 紀(jì)思羽, 吳靜, 王政, 劉藝平, 何松林. 牡丹不定根形成相關(guān)基因PsARRO-1的克隆及表達(dá)分析. 植物生理學(xué)報(bào), 2014, 50(8):1151-1158.

HE D, LI R, JI S Y, WU J, WANG Z, LIU Y P, HE S L. Cloning and expression analysis of adventitious rooting related geneof tree peony., 2014, 50(8): 1151-1158. (in Chinese)

[19] 崔海芳, 張凡, 尹俊龍, 郭瑛琪, 岳艷玲. 胼胝質(zhì)沉積與花粉發(fā)育. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2017, 32(3): 551-557.

CUI H F, ZHANG F,YIN J L,GUO Y Q,YUE Y L. Callose deposition and pollen development., 2017, 32(3): 551-557. (in Chinese)

[20] 李明, 李長(zhǎng)生, 趙傳志, 李愛芹, 王興軍. 植物SPL轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展. 植物學(xué)報(bào), 2013, 48(1): 107-116.

LI M, LI C S, ZHAO C Z, LI A Q, WANG X J. Research advances in plant SPL transcription factors., 2013, 48(1): 107-116. (in Chinese)

[21] SHEORAN I S, PEDERSEN E J, ROSS A R S, SAWHNEY V K. Dynamics of protein expression during pollen germination in canola ()., 2009, 230(4): 779-793.

[22] 陶璐, 岳訓(xùn). 擬南芥花粉管與柱頭互作的乙醇代謝耦合模型. 生物信息學(xué), 2015, 13(1): 47-53.

TAO L, YUE X. Ethanol metabolism coupling model betweenpollen tube and stigma., 2015, 13(1): 47-53. (in Chinese)

[23] 于曉英, 盧向陽(yáng), 陳永華, 李達(dá), 姚覺, 張宏志. 瓜葉菊熱脅迫下的基因差異表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 15(3): 459-463.

YU X Y, LU X Y, CHEN Y H, LI D, YAO J, ZHANG H Z.Differential gene expression of×under heat stress., 2007, 15(3): 459-463. (in Chinese)

[24] QIN Y, YANG Z B. Rapid tip growth: insights from pollen tubes., 2011, 22(8): 816-824.

[25] 陳坤明. 磷酸肌醇信號(hào)途徑對(duì)青扦花粉萌發(fā)和花粉管發(fā)育的調(diào)控作用及蘆葦葉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的生理生態(tài)學(xué)研究[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院, 2006.

CHEN K M. The mechanism of phosphoinositide signaling pathway involved in pollen germination and pollen tube growth ofand the ecophysiology of cell wall in the reed leaves [D]. Beijing: Chinese Academy of Sciences, 2006. (in Chinese)

[26] SALEM T, MAZZELLA A , BARBERINI M L, WENGIER D, MOTILLO V, PARISI G, MUSCHIETTI J. Mutations in two putative phosphorylation motifs in the tomato pollen receptor kinaseshow antagonistic effects on pollen tube length., 2011, 286(6): 4882-4891.

[27] LI S, SAMAJ J, FRANKLIN-TONG V E. A mitogen-activated protein kinase signals to programmed cell death induced by self-incompatibility inpollen., 2007, 145(1): 236-245.

[28] 葉芯妤, 邱雪梅, 王月, 李忠光. 乙二醛酶系統(tǒng)及其在植物響應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境脅迫中的作用. 植物生理學(xué)報(bào), 2019, 55(4): 401-410.

YE X Y, QIU X M, WANG Y, LI Z G. Glyoxalase system and its role in response and adaptation of plants to environmental stress., 2019, 55(4): 401-410. (in Chinese)

[29] SINGLA-PAREEK S L, REDDY M K, SOPORY S K. Genetic engineering of the glyoxalase pathway in tobacco leads to enhanced salinity tolerance., 2003, 100(25): 14672-14677.

[30] HAFERKAMP I, HACKSTEIN J H P, VONCKEN F G J, SCHMIT G, TJADEN J. Functional integration of mitochondrial and hydrogenosomal ADP/ATP carriers in themembrane reveals different biochemical characteristics for plants, mammals and anaerobic chytrids., 2010, 269(13): 3172-3181.

[31] 杜玉虎, 張紹鈴. 溫度對(duì)果梅離體花柱S-RNase識(shí)別特異性的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(9): 2734-2740.

DU Y H, ZHANG S L. Effects of temperature on recognition specificity of stylar S-RNase in vitro in., 2008, 41(9): 2734-2740. (in Chinese)

[32] 吳巨友, 李啟明, 王鵬, 張紹鈴. 梨自交不親和性反應(yīng)S-RNase新靶點(diǎn)—微絲骨架. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 41(5): 7-9.

WU J Y, LI Q M, WANG P, ZHANG S L. Actin cytoskeleton is a new target of S-RNase in self-incompatibility of pear., 2018, 41(5): 7-9. (in Chinese)

[33] 孟冬. 蘋果MdABCF轉(zhuǎn)運(yùn)S-RNase至花粉管影響自交不親和反應(yīng)[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

MENG D. Apple MdABCF transport S-RNase into pollen tube effecting self-incompatibility [D]. Beijing: China Agriculture University, 2014. (in Chinese)

Selected Related Genes about Incompatibility of Distant Hybridizationby iTRAQ Analysis and Transcriptome

HE Dan1,2, XIE DongBo1, ZHANG JiaoRui1, HE SongLin1,2, LI ChaoMei1, ZHENG YunBing1, WANG Zheng1, LIU YiPing1, LI Yan1, LU JiuXing1

(1College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2Colleg of Horticulture Landscape Architecture, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453000, Henan)

【Objective】Distant hybrid breeding is the main method of cultivar improvement and breeding in tree peony and herbaceous peony, while cross-incompatibility is an important restriction for breeding rapid development. Based on the previous researches, the analysis on different protein of stigma in pollen-stigma interaction and transcriptome was further explored. The mechanism of cross-incompatibility between tree peony and herbaceous peony was revealed, so as to provide the theoretical support for hybridized breeding.【Method】The stigmas of combinations‘Fenyunu’ בFenyunu’ and‘Fenyunu’ בFengdanbai’ were harvested at 24 h after pollination, which were used as materials for isobaric tags and analysis for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and transcriptome, respectively. Bioinformatics was analyzed on the data of protein and transcriptome. Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) technique was used to validate the expression data of selected differentially expressed genes (DEGs). 【Result】iTRAQ was used to analyze DEPs of stigma of distant hybrid between tree peony and herbaceous peony, and the result showed that 685 DEPs were belonged to 188 pathways, in which 18 pathways were significantly enriched. There were four pathways with obvious difference in protein, including RNA degradation, mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, calcium signaling pathway, and phosphatidylinositol signaling system. In RNA degradation pathway, enolase, DnaK (HSP70), and GroEL (HSP60) were all down-regulated. In calcium signaling pathway, calmodulin (CALM) was down-regulated, while adenine nucleotide translocase (ANT) was up-regulated. In MAPK signaling pathway, Glyoxalase (GloI) was down-regulated. In phosphatidylinositol signaling system, CALM was also down-regulated. 6 genes were selected randomly to confirmed their expression by qRT- PCR, and the result showed that the expression profiles of the selected genes was in agreement with the results from protein analysis, and they were all down-regulated. A total of 52 998 annotated Unigenes were obtained by transcriptome sequencing, accounting for 40.37% of all Unigenes. Based on the RPKM (Reads Per Kilobase per Million) of six samples, 16 224 DEGs were obtained, among which13 61 were up-regulated, and 2 863 were down-regulated. Based on pathway enrichment analysis of DEGs, it indicated that the level of enrichment of DEGs in “Oxidative phosphorylation”, “ABC transporters” and “Biosynthesis of secondary metabolites” pathways were more significant and reliable than that of selfing. The genes related with incompatibility of distant hybridization were(Callose enzyme), and, which were up regulating expression, butthat was down regulating expression. 【Conclusion】In the data of transcriptome and protein, 6 proteins and 4 genes were closely related to incompatibility of distant hybridization. These proteins and genes might play an important role in incompatibility of distant hybridization.

;; iTRAQ; transcriptome; distant hybridization

2019-08-12；

2019-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31600568，31870698）、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（KJCX2015A03，KJCX2018A05）、河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（192102110062，202102110234）、河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（19A220003）

賀丹，E-mail：dandan990111@163.com。通信作者何松林，E-mail：hsl213@yeah.net

（責(zé)任編輯 趙伶俐）