海南三亞和黃淮海地區玉米小斑病菌致病性及遺傳多樣性分析

常佳迎，劉樹森，石潔，郭寧，張海劍，馬紅霞，楊春鳳

海南三亞和黃淮海地區玉米小斑病菌致病性及遺傳多樣性分析

常佳迎，劉樹森，石潔，郭寧，張海劍，馬紅霞，楊春鳳

（河北省農林科學院植物保護研究所/農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室/河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心，河北保定 071000）

【目的】明確海南三亞玉米南繁基地和黃淮海玉米主產區的玉米小斑病菌（）菌株的致病性差異，以及遺傳多樣性和親緣關系的遠近，為海南三亞南繁基地育種過程中玉米品種的抗病性篩選提供理論依據，并對玉米品種在黃淮海地區的推廣種植提供參考。【方法】對采集自海南三亞和黃淮海地區的玉米小斑病病葉進行病原菌分離，經過形態學和分子生物學方法對分離到的菌株進行鑒定，共獲得61株玉米小斑病菌菌株。采用人工噴霧接種法對61株小斑病菌菌株的致病力進行鑒定；并選取16條擴增條帶清晰、重復性好、多態性高的引物進行ISSR-PCR擴增，利用Popgen32生物軟件計算群體間的遺傳距離和遺傳相似性，并利用NTsys2.10e軟件進行聚類分析，構建海南三亞與黃淮海地區小斑病菌的聚類圖。【結果】致病性測定結果表明，海南三亞地區未分離到弱致病力菌株，強致病力菌株個數占三亞地區總菌株的57.1%；黃淮海地區分離到的弱致病力菌株占黃淮海地區總菌株的47.5%，強致病力菌株占黃淮海地區總菌株的17.5%。遺傳多樣性分析結果表明，在群體平均水平上，Nei’s基因多樣性指數（H）為0.2820，Shannon’s信息指數（I）為0.4197，表明玉米小斑病菌具有一定的遺傳變異；不同地理種群間的遺傳相似系數為0.9028—0.9618，遺傳距離為0.0390—0.1023，表明整體遺傳相似系數較高，遺傳距離較近；但不同地理種群間仍存在不同程度的遺傳分化，其中，河南與河北的菌株群體遺傳相似系數最高（GS=0.9618），親緣關系最近；河南和三亞地區的菌株群體遺傳相似系數最低（GS=0.9028），親緣關系相對較遠。聚類分析結果表明，三亞地區菌株和黃淮海地區菌株在相似系數為0.722時，明顯被分為兩大類群。【結論】黃淮海玉米主產區與海南三亞玉米南繁基地的玉米小斑病菌在致病力上存在一定差異，三亞地區強致病力菌株的分離頻率高于黃淮海地區。黃淮海地區與三亞地區的菌株群體具有豐富的遺傳多樣性，且遺傳多樣性與地理來源有一定關系，地域相鄰的菌株遺傳關系較近；但三亞地區與黃淮海地區的菌株遺傳相似系數相對較高，親緣關系較近，且兩種群間存在一定基因交流。因此，三亞地區作為玉米的南繁基地，其自然發病條件下篩選出對小斑病具有抗性的玉米品種或抗性親本材料，對黃淮海地區小斑病抗性的逐年提高具有一定的影響，有利于減輕黃淮海地區病害的發生。

玉米小斑病菌；玉米小斑病；南繁基地；海南三亞；黃淮海地區；致病性；遺傳多樣性

0 引言

【研究意義】玉米是中國主要的糧食作物之一，具有很高的營養價值，也是重要的飼料作物和工業原料，其經濟地位不容忽視。隨著玉米種植面積的逐年增長，栽培模式向輕簡化發展，生產上對抗病品種的需求日益迫切。目前，有能力采用人工接種技術選育抗病品種的單位和育種家較少，在常年發病較重區域設置自然鑒定圃是育種家的首選。海南省三亞市作為玉米育種擴繁加代的一個重要地區，其小斑病發生較為普遍。能否依據品種（系）在海南田間小斑病的自然發病結果，淘汰抗性差的品種（系），選擇抗性較好的品種（系），并在黃淮海夏玉米種植區應用是一個亟待解決的問題。因此，明確三亞地區與黃淮海地區病原菌致病性和遺傳多樣性上的差異，對育種過程中玉米品種小斑病抗性篩選及其在黃淮海地區種植具有重要意義。【前人研究進展】玉米小斑病是黃淮海和南方玉米種植區主要的葉部病害之一，其致病菌為玉蜀黍平臍孺孢（），可在玉米全生育期侵染引起病癥，具有較強的侵染性和致病力[1-3]。在適宜的條件下，玉米小斑病菌可在接種24 h后侵染引起葉片壞死[4]，隨后在病斑上產生的分生孢子可借助氣流傳播，成為再侵染源[5]。玉米小斑病的發生和流行嚴重影響了玉米的產量和品質，發病較輕的地塊可造成10%—30%的產量損失，重病田減產高達80%[6-8]。研究表明，小斑病菌不同菌株在菌絲生長速率、產孢量、菌落特征等生物學特性方面存在差異[9-10]；不同菌株對相同玉米品種的致病性存在明顯差異[1-3]。簡單序列重復區間擴增多態性（inter-simple sequence repeat，ISSR）分子標記技術具有操作簡單、穩定性好、多態性高等優點[11-12]，目前廣泛應用于病原菌的遺傳多樣性分析，如玉米灰斑病菌（spp.）[13]、玉米大斑病菌（）[14]、玉米圓斑病菌（）[15]等。郭云燕等[16]利用ISSR分子標記技術對不同省份間的玉米南方銹病病原菌（）進行分析，探討了其病原菌初侵染來源；馬紅霞等[17]采用ISSR-PCR方法對不同地區的禾谷鐮孢（）復合種進行了遺傳多樣性分析，結果表明不同地理種群間遺傳多樣性與地理來源有關；常佳迎等[18]采用ISSR分子技術分析了黃淮海地區不同年份的彎孢葉斑病菌（），結果表明年度間菌株具有一定差異，推測菌株的初侵染源為外來菌源；梅玉云[19]和廖蕾[20]采用ISSR分子標記技術分別對安徽省不同地區和福建省不同地區的小斑病菌進行遺傳多樣性分析，結果表明小斑病菌群體存在豐富的遺傳多樣性，同一省份內不同地區菌株的親緣關系與地理來源有一定的相關性。【本研究切入點】玉米小斑病菌具有較強的寄主適應性和致病力，且來自同一省份不同地區的菌株致病性和遺傳多樣性存在差異，但海南三亞地區與黃淮海地區的病原菌致病性和親緣關系并未明確報道。【擬解決的關鍵問題】對采集自海南三亞和黃淮海地區的玉米小斑病菌菌株進行致病性和遺傳多樣性差異分析，了解兩地菌株的致病性差異和親緣關系的遠近，明確三亞地區自然發病條件下篩選獲得的玉米材料在黃淮海地區是否具有種植價值，以期為周年內兩代抗病育種工作的順利進行提供參考。

1 材料與方法

試驗于2018年10月至2019年6月在河北省農林科學院植物保護研究所完成。

1.1 材料

供試菌株：2018年9月從河北、河南和山東省采集夏玉米小斑病病葉，2019年2月從海南省三亞市采集南繁玉米小斑病病葉，放置于標本夾中，待水分去除后轉入干燥信封袋中保存備用。采用常規病害組織分離法[21]和單孢純化法[22]獲得病原菌，對獲得的病原菌進行形態學和分子生物學鑒定（ITS序列分析），共獲得61株玉蜀黍平臍蠕孢（表1）。

供試品種：選用小斑病感病自交系B73進行病原菌致病性測定。

1.2 致病性分析

1.2.1 病原菌擴繁 將分離獲得的61個菌株分別轉接至PDA培養基平板上，黑暗條件下30℃培養5 d后，轉接到高粱粒培養基上培養10 d，用無菌水將分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液（1×105個/mL），加入0.01%吐溫20（V/V）備用。

1.2.2 室內致病性測定 在花盆（上口直徑：11.5 cm，下口直徑：10.5 cm，高：8.5 cm）中種植玉米自交系B73，每盆種植4株，共種植61盆，待玉米苗長至3葉期，采用人工噴霧接種的方法，噴施分生孢子懸浮液，每個菌株噴施1盆，且均勻噴施等量（10 mL）的分生孢子懸浮液。接菌后保濕48 h，7 d后調查發病情況，測量病斑大小，記錄病斑特征，采用透明刻度板（5 mm方格）評估發病面積。

1.3 遺傳多樣性分析

1.3.1 模板DNA的制備 將分離獲得的61個菌株分別接種到PDA培養基上，30℃培養7 d，收集氣生菌絲。采用真菌基因組提取試劑盒（北京艾德來生物科技有限公司），按照說明書提取各菌株的DNA。采用ND2000微量紫外分光光度計（Thermo，USA）測定所獲得的DNA質量和濃度，統一稀釋至30 ng·μL-1，于-20℃保存備用。

1.3.2 ISSR分析 根據梅玉云[19]和廖蕾[20]的研究，選取16條ISSR引物用于本試驗（表2）。ISSR反應體系：DNA模板1 μL（30 ng·μL-1），2×EsTaq Master Mix 10 μL，Primer（10 μmol·L-1）1.5 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min，94℃變性40 s，退火（視不同引物而定）45 s，72℃延伸1.5 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。

PCR擴增產物在1.8%瓊脂糖凝膠上以100 V，電流100 mA電泳55 min，使用GelDoc XR+凝膠成像系統照相。

1.3.3 數據分析 統計并記錄ISSR電泳圖譜條帶，在相同大小的位置有條帶的標記為1，無條帶的標記為0。采用Popgen32軟件進行數據分析，計算海南三亞和黃淮海地區群體間的Shannon’s多樣性指數、群體間的遺傳距離和遺傳相似性[23-24]；利用NTsys2.10e軟件，采用clustering模塊中的SAHN按照非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析，并構建系統聚類圖。

2 結果

2.1 不同地區小斑病菌的致病性分析

致病性測定結果表明，61株小斑病菌在玉米自交系B73上的致病力、病斑大小和病斑形狀存在明顯差異。病斑形狀可分為：受葉脈限制的長方形和不受葉脈限制的橢圓形，有明顯褐色邊緣和無褐色邊緣；病斑顏色分為淺黃色、黃褐色和深褐色（表1）。依據《中華人民共和國農業行業標準——玉米抗病蟲性鑒定技術規范（NY/T1248.2—2016）》的分級標準，并根據發病面積將致病力劃分為強、中、弱3個等級，發病面積≤10%為弱致病力菌株；10%＜發病面積≤30%為中等致病力菌株；發病面積＞30%為強致病力菌株。由表1可見，黃淮海地區40個菌株中有19個為弱致病力菌株，占黃淮海地區總菌株的47.5%，14個菌株為中等致病力菌株，占黃淮海地區總菌株的35.0%，7個為強致病力菌株，占黃淮海地區總菌株的17.5%；海南三亞地區的21個菌株中無弱致病力菌株，9個中等致病力菌株，占三亞地區總菌株的42.9%，其余12個菌株為強致病力菌株，占三亞地區總菌株的57.1%。觀察結果表明，在玉米品種上形成的病斑顏色深、無褐色邊緣的菌株致病力普遍較強。

表1 黃淮海地區和海南三亞小斑病菌的致病性測定

續表1 Continued table 1

續表1 Continued table 1

“-”：無褐色邊緣no brown edge；“+”：有褐色邊緣With brown edges

2.2 不同地區小斑病菌的遺傳多樣性

2.2.1 不同地區小斑病菌的遺傳多態性分析 選取的16條引物具有較好的多態性，共獲得177個條帶，分布在100—10 000 bp，其中多態性條帶140個，占79.10%。不同引物擴增獲得的條帶數目為7—17條，平均每個引物獲得9個多態性條帶，其中引物808獲得條帶數最多（17條），引物812獲得的條帶數最少，僅為7條；16條引物的多態性條帶比率為44.44%—100.00%（表2）。

將61株小斑病菌按省份分為4個地理種群，其遺傳多態性分析如表3所示。在群體平均水平上，多態性位點為140個，多態性位點平均比率為79.10%，觀察等位基因數（Na）為1.7910，有效等位基因數（Ne）為1.4904，Nei’s基因多樣性指數（H）為0.2820，Shannon’s信息指數（I）為0.4197，表明玉米小斑病菌具有一定的遺傳變異。

不同地理來源的種群間，H值在0.1717—0.2783，I值在0.2505—0.4072，表明不同地理種群間的玉米小斑病菌遺傳多樣性具有一定差異。總體而言，河北（0.2783）和海南三亞（0.2437）種群遺傳多樣性較高，河南（0.2137）種群次之，山東（0.1717）種群較低（表3），基因多樣性指數的差異可能受分析所用種群中菌株數量的影響。

分析得到4個地理種群總基因多樣性（Ht）為0.2664，各地理種群內基因多樣性（Hs）為0.2268，地理群體間的基因多樣性（Dst）為0.0396，表明相同省份來源的菌株具有較近的親緣關系。地理種群間的基因分化系數（Gst）為0.1484，這說明不同地理種群間遺傳變異占種群總遺傳變異的14.84%，大部分遺傳變異（85.16%）發生在種群內。根據遺傳分化系數估算的基因流的值Nm=2.8690（＞1），表明地理種群間存在一定的基因交流。

2.2.2 不同地區小斑病菌的遺傳相似性分析 為進一步分析玉米小斑病菌各地理種群間的遺傳分化程度，將分離到的61株小斑病菌按省份分組，計算Nei’s遺傳相似性（GS）和遺傳距離（GD）（表4）。不同地理種群間的遺傳相似系數為0.9028—0.9618，遺傳距離為0.0390—0.1023。遺傳相似系數均＞0.9000，遺傳距離最大僅為0.1023，表明整體遺傳相似系數較高，遺傳距離較近；但不同地理種群間仍存在不同程度的遺傳分化。其中，河南與海南的菌株群體遺傳相似系數相對較低（GS=0.9028），遺傳距離較遠（GD=0.1023），親緣關系相對較遠；河北與河南的遺傳相似系數相對較高（GS=0.9618），遺傳距離相對較近（GD=0.0390），親緣關系較近。

表2 ISSR引物擴增結果

2.2.3 不同地區菌株間親緣關系的聚類分析 利用NTsys2.10e軟件對61株小斑病菌進行ISSR聚類分析，菌株間具有豐富的遺傳多樣性，相似系數在0.71—0.95（圖1）。在相似系數為0.722時，所有的菌株被分成兩大群（Group 1和Group 2）。在相似系數為0.74時，Group 1可分為2個亞群，subgroupⅠ包含1個河南菌株，2個三亞菌株，13個河北菌株；subgroupⅡ包含2個山東菌株，2個三亞菌株，9個河南菌株，11個河北菌株。Group 2包含1個山東菌株，3個河北菌株，17個三亞菌株。根據ISSR聚類分析結果，黃淮海地區的菌株多分布于Group 1，而三亞地區的菌株群體多分布于Group 2。

圖1 玉米小斑病菌的UPGMA聚類分析

表3 玉米小斑病菌不同地理種群的遺傳多樣性水平

表4 玉米小斑病菌不同地理種群間的遺傳相似性和遺傳距離

對角線上方為遺傳相似系數，下方為遺傳距離Nei’s genetic similarity coefficient (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

3 討論

研究表明，玉米小斑病菌致病力分化十分明顯[25]，且小斑病菌的毒力與地理位置無關[26]，不同菌株對相同玉米品種/自交系的致病力不同，且形成的病斑類型均有明顯差異[1-3]。在中國玉米產區具有強致病力和中等致病力的小斑病菌菌株占有明顯優勢[27-28]。本研究結果表明，不同菌株在同一個玉米自交系上造成的病斑類型不同，病斑大小也存在一定差異。海南三亞地區未分離到弱致病力菌株，強致病力菌株占三亞地區總菌株的57.1%，為優勢種群；黃淮海地區分離到的弱致病力菌株占黃淮海地區總菌株的47.5%，為主要種群，強致病力菌株占17.5%，因此海南三亞地區強致病力菌株的分離頻率高于黃淮海地區。推測可能是受黃淮海玉米種植區推廣抗病品種的影響，導致病原菌的致病力減弱；而在海南三亞地區進行材料的南繁，不考慮材料的抗病性，其南繁材料中大部分對小斑病表現更為敏感，因此在三亞也聚集了更多的強致病力菌株。

本研究通過對分離自黃淮海地區和海南三亞地區的61株玉米小斑病菌的ISSR片段多樣性進行分析，共獲得140個多態性條帶，多態性比率為79.10%，表明黃淮海地區和三亞地區的小斑病菌具有豐富的遺傳變異，不同地理種群間小斑病菌的遺傳多樣性具有一定差異，這與梅玉云[19]和廖蕾[20]的研究結果一致。不同地理種群間的遺傳相似系數和遺傳距離表明，整體遺傳相似系數較高，遺傳距離較近；但地理種群間存在地域相鄰，遺傳關系相對較近，遺傳相似系數較高的特點。聚類分析顯示，海南三亞與黃淮海地區的小斑病菌具有一定地理隔離，且小斑病菌的遺傳親緣關系與地理來源有一定的相關性；但Group 1中包含4個三亞地區的菌株而Group 2包含4個黃淮海地區的菌株，同時遺傳分化系數估算的基因流的值Nm=2.8690（＞1），表明黃淮海和海南三亞地區地理種群間存在一定的基因交流，可能是在育種材料的調運過程中隨種子、穗軸苞葉等傳播，以及北上氣流的影響，導致部分菌株在三亞和黃淮海地區的交叉定殖。鑒于海南的小斑病菌致病力更強，今后應加強該病害的檢疫和監測工作。

王群[29]對299份山東省玉米引種備案品種（系）和101份黃淮海玉米趨勢試驗品種（系）進行玉米小斑病的抗性鑒定，結果顯示表現為高抗和抗病的品種占96.25%，沒有表現高感的玉米品種；施艷等[30]鑒定了2015—2017年河南省夏玉米品種對小斑病的抗性，結果表明中抗品種占主要地位，而具有抗性的品種比率呈逐年上升趨勢，且同一品種在不同年份抗性表現較為穩定；陸銀萍[31]采用人工噴霧法檢測了安徽省2010—2014年參與鑒定的696個玉米品種對小斑病的抗性，發現抗性等級為高抗和中抗的品種占鑒定總數的比例呈總體上升趨勢；由此可見，黃淮海地區近年來的主栽品種對小斑病的抗性提高，可能得益于育種過程中對品種抗病性的篩選。同時，建議育種家對已經形成的有望生產應用的組合在海南三亞地區開展小斑病抗性鑒定工作，也可在品種選配中采用在三亞表現抗小斑病的親本，在較高壓力下確定新品種的抗性水平，組配出抗小斑病的品種。

海南三亞作為玉米南繁育種的重要基地，其小斑病發生普遍，本研究結果證明三亞地區強致病力菌株所占比例較黃淮海地區高，三亞地區菌株與黃淮海地區菌株的整體遺傳相似系數較高，遺傳距離較近，且兩地之間的菌株存在一定的基因交流。因此，在三亞地區田間育種過程中，根據田間自然發病情況對品種的抗病性進行篩選具有一定意義，有利于篩選出對小斑病抗性較好的玉米品種。因黃淮海地區弱致病菌群占主要地位，因此對于在海南田間小斑病發生較重的玉米品種（系），若其他田間性狀（如產量等）表現較好，可在黃淮海田間進行多點抗性測試，進一步明確其抗性后，再決定是否淘汰。

4 結論

黃淮海玉米主產區與海南三亞玉米南繁基地的玉米小斑病菌在致病力上存在一定差異，黃淮海玉米主產區小斑病菌菌株以弱致病菌群為主，海南三亞以強致病菌群為主。遺傳多樣性分析結果表明，黃淮海地區與三亞地區的菌株群體具有豐富的遺傳多樣性，兩地菌株整體遺傳相似系數較高，遺傳距離較近，且兩地之間的菌株存在一定的基因交流。三亞地區作為玉米的南繁基地，其自然發病條件下篩選出具有小斑病抗性的玉米品種或抗性親本材料，對于黃淮海玉米種植區小斑病抗性的逐年提高有一定的影響，其篩選具有應用價值。

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Pathogenicity and Genetic Diversity ofin Sanya, Hainan and Huang-Huai-Hai Region

CHANG JiaYing, LIU ShuSen, SHI Jie, GUO Ning, ZHANG HaiJian, MA HongXia, YANG Chunfeng

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Centre of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to clarify the pathogenicity differences, genetic diversity and relationship among thestrains from southern maize breeding base of Sanya, Hainan and Huang-Huai-Hai region, and to provide a theoretical basis for screening resistance of maize varieties under natural disease conditions in the breeding process. It also provides a reference for the popularization and utilization of maize varieties in Huang-Huai-Hai region.【Method】The pathogens were isolated from diseased leaves collected from Sanya, Hainan and Huang-Huai-Hai region, and a total of 61 strains were obtained by identification of morphology and molecular biology. The pathogenicity of 61 strains was identified by an artificial spray inoculation method, and 16 primers with clear, repetitive and polymorphic bands were used for ISSR-PCR. Popgen32 software was used to calculate the genetic distance and genetic similarity among the populations, and NTsys2.10e software was used for cluster analysis and constructing a cluster map of the pathogens in Sanya, Hainan and Huang-Huai-Hai region.【Result】The results of pathogenicity test showed that there was no weak pathogenic strain and 57.1% strong pathogenic strains isolated from Sanya, Hainan, while that of Huang-Huai-Hai region accounted for 47.5% and 17.5%, respectively. The results of genetic diversity analysis showed that the Nei’s gene diversity index (H) was 0.2820 and Shannon’s information index (I) was 0.4197 on the average level of population, indicating that there was a certain genetic variation in the pathogen. The genetic similarity coefficient was 0.9028-0.9618 and the genetic distance was 0.0390-0.1023 among different geographical populations, which indicated that the overall genetic similarity coefficient was relatively high and the genetic distance was close, but there were still different degrees of genetic differentiation among different geographical populations. Among which, the genetic similarity coefficient of strains in Henan and Hebei was the highest (GS=0.9618), and the genetic relationship was the closest; the genetic similarity coefficient of strains in Henan and Sanya was the lowest (GS=0.9028), and the genetic relationship was relatively far. The cluster analysis showed that the strains in Sanya and Huang-Huai-Hai region were obviously divided into two groups when the similarity coefficient was 0.722.【Conclusion】There are some differences inpathogenicity between the main maize producing area of Huang-Huai-Hai region and the southern maize breeding base of Sanya, Hainan. The isolation frequency of the strong pathogenic strains in Sanya was higher than that in Huang-Huai-Hai region. The strain populations in Huang-Huai-Hai region and Sanya region have rich genetic diversity, and genetic diversity has a certain relationship with geographical origin. The genetic relationship of the strains in the adjacent regions was relatively close. However, the genetic similarity coefficient of strains between Sanya region and Huang-Huai-Hai region is relatively high, the genetic relationship is close, and also there are some gene exchanges between the two populations. Therefore, selection of resistant maize varieties or resistant parent materials under natural conditions in southern maize breeding base of Sanya has a certain effect on the yearly increase of resistance to southern corn leaf blight in Huang-Huai-Hai region, which is helpful to reduce the occurrence of disease in Huang-Huai-Hai region.

;southern corn leaf blight; southern maize breeding base; Sanya, Hainan; Huang-Huai-Hai region; pathogenicity; genetic diversity

2019-09-04；

2019-10-23

國家現代農業產業技術體系（CARS-02）

常佳迎，E-mail：cjy198908@163.com。通信作者石潔，E-mail：shij99@163.com

（責任編輯 岳梅）