基于二代測序的甘藍型油菜白花基因候選區間定位及連鎖標記驗證

陳雪，王瑞，井付鈺，張勝森，賈樂東，段謀正，吳宇

基于二代測序的甘藍型油菜白花基因候選區間定位及連鎖標記驗證

陳雪，王瑞，井付鈺，張勝森，賈樂東，段謀正，吳宇

（西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715）

【目的】近幾年隨著觀光農業的興起，花色的選育和改良已成為甘藍型油菜種質資源鑒定和材料創制的重要研究方向。以甘藍型油菜黃白花分離F2群體為研究對象，通過二代測序技術，對白花性狀基因候選區間定位，開發與白花性狀連鎖的分子標記，為定位白花候選基因和選育白花新材料提供新思路?！痉椒ā恳愿仕{型油菜DH純系黃花Y05和甘藍型油菜純系白花W01雜交，觀察F1和F2群體的花色分離，分析白花性狀遺傳模式。在F2群體中選取30株純白花和30株純黃花構建DNA葉片子代池和RNA花瓣子代池，對親本和DNA葉片子代池進行30×重測序，對RNA花瓣子代池進行5×測序。以法國甘藍型油菜Darmor-bzh、中雙11、Darmor、Tapidor為參考序列，重測序QTL-seq分析流程計算2個DNA子代池的SNP-index和delta（SNP-index）。利用R包畫出SNP-index和delta（SNP-index）滑窗分析圖，鑒定候選區間。轉錄組MMAPPR分析流程以法國甘藍型油菜Darmor-bzh為參考序列，計算SNP頻率，ED4（Loess fit）檢測峰值和鑒定候選區間。利用MISA進行重復序列鑒定，使用Prime3在候選區間進行SSR引物設計，在F2群體中采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對SSR引物進行篩選?！窘Y果】甘藍型油菜黃花與白花雜交F2群體中，白花和黃花性狀分離比符合3﹕1，暗示白花性狀受1對顯性主效基因控制。全基因組重測序區間定位結果顯示，白花性狀基因候選區間在Darmor-bzh C03染色體52—55 Mb。同時以甘藍型油菜中雙11、Darmor、Tapidor分別為參考序列，均鑒定出白花基因候選區間在C03染色體上的一致性和穩定性。轉錄組測序定位白花性狀基因位于Darmor-bzh C03染色體54—55 Mb。轉錄組測序和重測序定位染色體結果高度一致。在此區間內MISA和Primer3結合設計SSR引物，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選到6個與白花性狀緊密連鎖共分離的SSR標記。6個SSR標記區間范圍在760 kb（52.81—53.57 Mb）。此候選區間與甘藍、白菜共線性分析，對應白菜A02染色體56.76—57.40 Mb區間，對應甘藍C03染色體10.99—11.28 Mb區間?！窘Y論】甘藍型油菜白花性狀由1對顯性主效基因控制。白花性狀基因候選區間在法國甘藍型油菜Darmor-bzh C03染色體52—55 Mb區間內。此區間760 kb范圍內篩選出6個與白花性狀基因緊密連鎖共分離的SSR標記。

甘藍型油菜；白花；測序；候選區間；SSR

0 引言

【研究意義】甘藍型油菜屬十字花科（Cruciferace）蕓薹屬（）植物，是中國重要油料作物[1]，可作為食用植物油、蛋白質飼料和能源的原料作物。近幾年，隨著油菜不同花色品種示范與推廣，帶動了鄉村觀光旅游，促進了農民增收。因此，加快選育創制不同遺傳背景的油菜花色新品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】油菜白花花瓣不僅有觀賞和裝飾價值，還可以轉育不育系和恢復系，成為鑒定雜交種純度的指示性狀。油菜的白花性狀很早就有報道。PERSON等[2]發現一種白菜白色花突變體，證明白色是由單個顯性基因控制的。種間雜交也會產生白色花。CHEN等[3]、HENEEN等[4]、ZHANG等[5]利用白菜和甘藍人工雜交，獲得甘藍型油菜白花品系。通過多年對油菜白花遺傳模式和遺傳效應研究，發現白花性狀為顯性并且沒有細胞質效應[6-7]。JAMBHULKAR等[8]在埃塞俄比亞芥中發現白花性狀是由1對不完全顯性基因控制。芥菜型油菜白花性狀是由2對基因互作影響[9-10]。多位學者研究甘藍型油菜白花由1對核基因控制，白花對黃花為顯性[11-13]。分子標記輔助選擇是轉育質量性狀的重要技術手段。LIU等[13]鑒定出白花性狀由5個QTL控制。HAN等[14]通過InDel標記將甘藍白花性狀定位于C03染色體上。HUANG等[12]利用AFLP和SSR得到與白花基因連鎖的2個標記，距離為3.0和3.2 cM。ZHANG等[11]構建回交和DH群體，用AFLP和SSR標記把甘藍型油菜白花定位到C03染色體上，再與甘藍參考組序列比對，獲得白花候選基因CCD4。近年來，基于二代測序的BSA分析技術為質量性狀或主效基因快速準確定位提供了強大工具。目前，已在水稻[15-17]、小麥[16]、大豆[18]、番茄[19]、黃瓜[20-22]等作物中用于對質量性狀或主效基因進行遺傳定位研究，快速篩選靶基因獲得緊密連鎖分子標記。在利用BSA重測序定位油菜花色方面，YAO等[23]將甘藍型油菜橙色花性狀基因定位于C09染色體151 kb區間，在此區間開發了連鎖SSR和InDel標記。ZHANG等[24]利用BSA重測序將芥菜型白花性狀定位于B04染色體，區間為2.45 Mb，并開發出SSR連鎖標記。【本研究切入點】迄今為止，已有多位作者運用傳統分子標記技術將白花相關基因定位到C03染色體，并開發了緊密連鎖的分子標記。但利用二代測序技術快速精準定位甘藍型油菜白花基因候選區間仍鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過甘藍型油菜黃花DH系和白花DH系雜交，對獲得的F2代2個極端子代池開展全基因組重測序和轉錄組測序，定位白花基因候選區間。在區間內設計SSR引物，用SSR連鎖標記驗證候選區間定位的準確性，為精細定位白花候選基因和分子標記輔助選育甘藍型油菜白花新材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

西南大學油菜生物學團隊將甘藍型油菜和羽衣甘藍遠緣雜交，在分離群體中，獲得白花突變體，再與甘藍型油菜多代回交獲得甘藍型白花油菜，同時小孢子加倍獲得甘藍型白花純系DH材料W01。DH純系黃花材料Y05是通過小孢子加倍選育的隱性純系臨保系。2016年用DH純系黃花Y05與純系白花W01雜交獲得F1，次年獲得F2。從F2分離群體中選取極端白花單株和極端黃花單株，構建白花子代池和黃花子代池，用于白花基因候選區間定位。

1.2 田間試驗和性狀調查

2017年3月花期，F1單株自交獲得F2。2017年9月25日對親本和F2進行小區育苗，10月將單株移栽到西南大學歇馬油菜基地試驗田，行距為0.2 m，株距為0.2 m。2017年12月苗期對F2群體213個單株插牌編號。2018年3月初花期和盛花期對F2群體213個單株分別記錄花色。

1.3 子代池構建

2017年12月苗期，對親本Y05和W01以及F2群體每個單株按插牌編號取幼嫩葉0.2 g。2018年3月初花期和盛花期按苗期插牌編號記錄單株花色。選取極端純白花30株和極端純黃花30株，對應到苗期編號取幼嫩葉。利用OMEGA HP Plant DNA試劑盒對2個親本和極端黃、白花的幼嫩葉提取DNA。將純白花幼嫩葉和純黃花幼嫩葉各30株的DNA等量混合，構建白花DNA子代池和黃花DNA子代池。在F2群體處于初花期時，選取純白花和純黃花各30株，取每株剛張開的花瓣0.15 g，利用EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kits試劑盒提取RNA。將極端純白花花瓣和極端純黃花花瓣各30株的RNA等量混合，構建白花RNA子代池和黃花RNA子代池。2個DNA子代池和2個親本DNA建庫類型為DNA-350 bp，以illumina HiSeq PE150方法測序，測序深度為30×。2個RNA子代池建庫類型為DNA-300 bp，以illumina HiSeq PE125方法測序，測序深度為5×。

1.4 數據處理

對DNA子代池和2個親本30×重測序的原始數據去除接頭和低質量序列，得到分析數據。啟動QTL-seq shell流程[25]，FASTX-TOOLKIT軟件過濾低質量reads；將過濾后的親本reads與法國甘藍型油菜參考組Darmor-bzh Brassica_napus.v4.1.fa（http://www. genoscope.cns.fr/ brassicanapus/）比對，并替換SNP，構建親本參考組，再將親本reads重新與新構建的親本參考基因組比對，發現錯配造成的SNP，用于后續的排除和過濾。將2個DNA子代池質控過濾后的reads分別與親本參考基因組比對。使用Coval Refine對比對結果進行過濾，Coval Call檢測變異位點，排除由于錯配導致的SNP位點，計算2個DNA子代池的SNP-index以及2個子代池之間的delta（SNP-index）。利用R包畫出SNP-index和delta（SNP-index）滑窗分析圖，鑒定候選區間。

RNA子代池測序數據需要以下預處理：利用bwa軟件將白花RNA子代池和黃花RNA子代池測序數據與法國甘藍型油菜參考基因組Darmor-bzh比對，對得出的sam文件進行sort排序，去除PCR重復，建立索引文件。GATK軟件再重新比對獲得白花子代池和黃花子代池bam文件，啟動MMAPPR分析流程[26]，計算SNP頻率，Loess fit of ED4檢測峰值和鑒定候選區間。

1.5 引物設計與電泳

利用MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）進行重復序列鑒定并使用Prime3在候選區間進行SSR引物設計，引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。隨機選取F2群體極端黃花和極端白花各11株幼嫩葉DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系為2.2 μL模板DNA、0.25 μL 2.5 mmol·L-1dNTP、前后引物各0.36 μL、0.31 μL Taq酶（2.5 U·μL-1）、1.9 μL 10×PCR buffer（含Mg2+）。PCR程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃—60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環；72℃ 5min；4℃保存。PCR擴增產物經8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離60min，用銀染法進行顯影。

2 結果

2.1 黃花Y05和白花W01組合后代表型觀察和遺傳分離

甘藍型油菜黃花DH純系Y05與白花純系W01雜交，F1均為白花，F2呈明顯主效基因分布特點，白花對黃花為顯性性狀。F2群體中純白花和純黃花分離明顯（圖1）。

對2年田間試驗數據進行卡方測驗，結果表明，黃白花性狀分離比符合3﹕1的分離規律（表1），暗示白花性狀受1對顯性主效基因控制。

2.2 重測序DNA子代池數據分析

分別用已發表的法國甘藍型油菜[27]Brassica_ napus.v4.1.fa（http://www.genoscope.cns.fr/ brassicanapus/）、甘藍型油菜中雙11[28]（http://ocri-genomics.org/Brassia_ napus_genome_ZS11/）、2個澳大利亞甘藍型油菜[29]（Darmor、Tapidor（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ 342383/;http://appliedbioinformatics.com.au/index.php/ Darmor_Tapidor/）為參考基因組序列。以2 Mb為窗口，50 kb步長對delta（SNP-index）在19條染色體上作圖。以95%和99%作為置信區間，置信水平以上窗口作為候選區間（圖2）。區間定位結果顯示，白花性狀基因候選區間在Darmor-bzh C03染色體52— 55 Mb，在ZS11 C03染色體62Mb左右，在Tapidor C03染色體48 Mb左右，在Darmor C03染色體61 Mb附近。以這4個甘藍型油菜基因組序列為參考組，均鑒定出白花基因候選區間在C03染色體上的一致性和穩定性。

A：黃花Y05；B：F2黃花；C：白花W01；D：F2白花

表1 黃花Y05與白花W01雜交F2花色分離比例

2.3 轉錄組子代池數據分析

MMAPPR[26]分析白花花瓣和黃花花瓣2個轉錄組子代池時，需要更改參考組Darmor-bzh基因序列染色體名稱以符合流程要求。將chr.A01—chr.A10、chr.C01—chr.C09更改為chr.1—chr.19。MMAPPR方法以2個子代池SNP頻率為基礎計算出ED4（Loess fit）（圖3），以0.6為閾值，白花性狀基因定位于chr.13（C03）染色體54—55 Mb。轉錄組測序和重測序定位染色體結果高度一致，僅定位區間有細小差別，可能是轉錄組子代池比對分析時，以法國甘藍型油菜Darmor-bzh為參考組，未利用親本信息，然后直接計算子代池SNP頻率所致。

2.4 SSR引物設計和聚丙烯酰胺電泳

依據法國甘藍型油菜Darmor-bzh參考序列，在C03染色體52—55 Mb區間運用MISA和Primer3結合設計SSR引物（表2）。篩選到6個能明顯區分F2極端黃花單株和極端白花單株的SSR標記（圖4）。6個標記大約在760 kb范圍之內。這6對SSR引物進行單株驗證均未檢測到交換株，推測控制白花性狀候選基因與這些SSR標記緊密連鎖共分離。

2.5 白花候選區間基因線性比對

6個SSR連鎖標記范圍確定的區間（52.81—53.57 Mb）內有80個注釋基因。利用https://gsthub.com/ tanghaibao/jcvi/Mcscan-(Python-version) python分析此候選區間基因與甘藍、白菜物種之間的共線性（圖5）。白菜A02染色體56.76—57.40 Mb區間有26個同源基因，甘藍C03染色體10.99—11.28 Mb區間有63個同源基因。甘藍與白菜種間雜交可人工合成甘藍型油菜，種間雜交合成的甘藍型油菜易出現白花性狀，共線性分析揭示了白花性狀相關同源基因由二倍體到四倍體物種的進化關系，暗示甘藍型油菜白花基因來源于甘藍或白菜。

全基因組（A）和染色體Chr.13（C03）（B）上SNP頻率對應的ED4（Loess fit）曲線

表2 SSR引物序列

A：SSR149；B：SSR154；C：SSR157；D：SSR161；E：SSR180；F：SSR222；M：20 bp ladder；1：親本Y05；2：親本W01；3—13：F2群體11個黃花單株；14—24：F2群體11個白花單株

圖5 甘藍型油菜與甘藍、白菜的白花基因候選區間線性比對

3 討論

3.1 基于二代測序正向遺傳學油菜白花性狀定位

以往對蕓薹屬白花性狀的研究主要集中在孟德爾遺傳模式、遺傳圖譜構建和連鎖分子標記開發以及輔助選擇。二代測序方法的迅速發展促進了正向遺傳學性狀定位。目前，僅有ZHANG等[24]構建了芥菜型白花性狀的回交群體，對分離后代黃白花子代池重測序，把白花性狀定位在B04染色體，區間約2.45 Mb。在此區間上設計SSR引物，用隱性單株群體把候選區間縮小至0.25 cM。而對甘藍型油菜白花性狀，利用二代測序方法快速精準定位甘藍型油菜白花基因候選區間仍鮮見報道。XIAO等[30]構建了甘藍型油菜黃花和白花的182株DH群體，利用黃白花各10株構建混池方法，在全染色體篩選SSR引物，找到5個與白花性狀連鎖的SSR標記，定位于C03染色體上。LIU等[31]再利用這5個與白花性狀連鎖最近的2個SSR標記序列與甘藍參考組比對，在甘藍對應的區間內又開發了9個SSR連鎖標記。ZHANG等[11]構建了白花和黃花的BC5F2群體，選取1120株黃花隱性單株，繼續使用這14個SSR標記進行精細定位。將與白花性狀基因最近的兩端SSR標記BoGMS3990和BoGMS3988序列與甘藍參考組和甘藍注釋文件比對，推測出此區間包含24個基因，其中一個為。比對到甘藍參考組C03染色體48.6Mb附近。由于調控類胡蘿卜素合成，暗示參與甘藍型油菜白花代謝調控。以上所述甘藍型油菜白花候選區間定位方法極為繁瑣并且成本昂貴。本研究結合使用QTL-seq和MMAPPR分析流程，以最新發布的法國甘藍型油菜Darmor-bzh序列為參考組[29]，僅用甘藍型油菜黃×白F2小群體，二代方法重測序和轉錄組測序相互驗證快速鑒定出甘藍型油菜白花性狀候選基因在C03染色體，物理區間為52—55 Mb。與ZHANG等[11]傳統方法相比，不需要構建復雜的定位群體，不依賴遺傳圖譜和大量分子標記，周期短效率高。白花性狀基因候選物理區間52—55Mb再通過與甘藍型油菜注釋文件區間比對，發現此區間3個MYB蛋白基因（、和）和3個WD40重復蛋白基因（、和）。MYB轉錄因子和WD40轉錄因子均是通過調控類黃酮代謝途徑，進而影響到色素的合成。因而，本研究獲得的甘藍型油菜白花候選基因物理區間和區間內有關色素基因與前人研究結果完全不同。

3.2 參考基因組選擇及親本信息利用

參考基因序列組裝質量越好，信息越全，注釋文件信息也相對齊全，對于后續基因定位和候選基因注釋都會更加準確，可以鎖定候選區間并估計候選區域的大小。由于法國甘藍型油菜Darmor-bzh序列組裝質量和注釋文件版本不斷更新，有學術團隊維護和發布最新版本，甘藍型油菜重測序和轉錄組分析流程中的參考組序列一般優先選用法國甘藍型油菜Darmor-bzh。但Darmor-bzh與本文中所測材料遺傳背景差異大，用親本序列替換后構建新參考組再進行比對，所獲結果就更加準確。QTL-seq分析2個子代池和親本重測序數據，親本reads與參考組Darmor-bzh序列進行替換，構建新的參考組提高比對率。以新參考組為參照比對2個子代池測序數據，進行SNP變異分析計算SNP-index和delta（SNP-index）。因而，本文設計SSR引物以QTL-seq流程利用Darmor-bzh參考組分析獲得的候選區間為依據。Darmor-bzh參考組52—55 Mb區間內，MISA軟件微衛星和復合微衛星識別，再使用Primer3進行SSR引物設計。選取2個子代池相減最高頻率的2 Mb區間內的20對SSR引物，用F2群體的極端白花單株和極端黃花單株驗證，獲得6個與白花性狀緊密連鎖共分離的SSR標記，這6個SSR標記在760 kb范圍之內，其中SSR 222標記與MYB蛋白基因物理距離小于16 kb。因此，下一步的工作需要擴大F2種植群體，利用6個共分離SSR標記同時開發新SSR和InDel連鎖標記對白花性狀基因進行精細定位，縮小候選基因范圍，為甘藍型油菜白花性狀基因圖位克隆奠定工作基礎。

4 結論

甘藍型油菜白花性狀基因在C03染色體52—55 Mb區間。在此區間760 kb范圍內篩選出6個與白花性狀基因緊密連鎖共分離的SSR標記。

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Location and Linkage Markers for Candidate Interval of the White Petal Gene inL. by Next Generation Sequencing

CHEN Xue, WANG Rui, JING FuYu, ZHANG ShengSen, JIA LeDong, DUAN MouZheng, WU Yu

(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】Since the petal colour can be used for ornamental and landscaping purposes, the petal color has been one of the major goals of breeding and genetic research inL.. In this paper, Genetic analysis, candidate interval identification, linkage markers and synteny analysis were applied to elucidate the genetic control of the white petal inL.. 【Method】 To Map the white petal locus, an inbred line Y05, which has yellow flowers, was crossed with an inbred line W01, which has white flowers. The F1plants were self-crossed to develop F2mapping population. For BSA, parental and two pools with 30 yellow petal lines and 30 white petal lines of F2were constructed by mixing an equal amount of DNA or RNA respectively. 30× or 5× depth of genome-sequencing was conducted. Darmor-bzh, Zhongshuang11(ZS11), Darmor and Tapidor as the reference genome were aligned to sequence data from the 2 bulks and parents using QTL-seq workflow. The sliding window method with a window size of 2Mb and a step size of 50kb was used to present the SNP indexes of the whole genome. The difference between the SNP indexes of the two pools was calculated as the delta (SNP- index). Candidate regions for petal color were identified from the chromosomes with 95% confidence intervals. Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-seq (MMAPPR) without parental strain information and requiring Darmor-bzh reference genome calculated allelic frequency by Euclidean distance followed by Loess regression analysis, and identified the region where the mutation lies, and generated a list of putative coding region mutations in the linked genomic segment. The SSR primers were designed by using MISA and Prime 3 for repeated sequence identification, and the SSR primers were screened by polyacrylamide gel electrophoresis in the F2population. 【Result】The segregation of white petal and yellow petal among F2population fitted the Mendelian segregation ratio of 3:1. This indicates that the white petal trait was controlled by a major gene and that white petal was dominant over yellow petal. The results of the candidate interval using whole-genome re-sequencing showed that a candidate interval (52-55 Mb) exceeding the threshold value was identified for the petal color on chromosome C03 when Darmor-bzh was used as reference genome. While ZS11, Darmor and Tapidor were aligned to sequence data, candidate intervals for white petal were all identified on chromosome C03. Linked region peaks (54-55 Mb) identified by MMAPPR for the petal color was on chromosome C03 of Darmor-bzh. Six SSR markers that were located in the interval (760 kb) were closely linked to the white flower gene. Synteny analysis showed that the interval 760 kb (52.81-53.57 Mb) was corresponding to chromosome A02 (56.76-57.40 Mb) ofand chromosome C03 (10.99-11.28 Mb) of【Conclusion】The white petal was controlled by a major gene which was dominant over yellow petal. Six SSR markers closely linked to the white petal gene were selected. A candidate interval for white petal gene was identified on chromosome C03 (52-55 Mb). The present study may facilitate cloning of the white petal gene as well as marker assisted selection.

L.; white petal; sequencing; candidate interval; SSR

2019-08-21；

2019-10-30

國家重點研發計劃“七大農作物育種”（2016YFD0101300）

陳雪，Tel：15683993928；E-mail：cx_526@163.com。通信000作者王瑞，Tel：13883344308；E-mail：ruiwang71@163.com

（責任編輯 李莉）