不同療程電針對放射性腦損傷模型小鼠認知功能及海馬神經元凋亡的影響＊

王冬慧，武 鑫，孫寧寧，高劍峰

（1. 河南中醫藥大學基礎醫學院 鄭州 450046；2. 河南中醫藥大學研究生院 鄭州 450046）

近年來，隨著癌癥發病率的不斷增高，放射線治療成為了治療腫瘤的一個重要手段，但放射線治療所引起的腦部損傷已成為限制放療的重要因素[1-2]，臨床研究表明放射線照射可引起學習記憶與認知功能受損，并且受損程度與照射劑量密切相關[3]，因此探討放射性腦損傷發病機制，以及電針干預對放射性腦損傷的防治具有重要意義。已有實驗發現海馬區是對放射線照射最敏感的區域，X 射線照射可造成神經元受損并引起腦退行性病變[4-5]。海馬區神經元功能的損傷直接影響放射性腦損傷的程度和恢復過程。

有研究發現2.3Gy 的X 射線可損傷Long-Evans 大鼠學習記憶能力[6]，本課題組發現不同劑量的X 射線照射后可不同程度地引起實驗小鼠空間學習記憶能力的下降，主要表現為在曠場實驗和Morris 水迷宮實驗中受照射小鼠學習記憶功能受損，即8Gy 以上放射劑量即建立腦輻射損傷模型[7-8]。電針在頭頸部腫瘤放療后的輔助治療中有廣泛運用，如對放射線治療后的口干、嘔吐等癥狀具有明顯改善效果[9-10]。電針對其他腦損傷的神經元凋亡具有一定抑制作用，對于阿爾茨海默病，電針通過抑制Bax同時上調Bcl-2可抑制阿爾茨海默病小鼠神經元凋亡，電針還可通過Notch3 信號通路抑制腦卒中小鼠海馬區神經元凋亡[7,11-12]。因此，本實驗采用電針干預“百會”、“風府”及雙側“腎俞”穴，觀察不同療程電針對放射性腦損傷小鼠海馬區神經元凋亡的影響，從神經元凋亡的角度探討不同療程電針干預對放射線照射小鼠腦損傷的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1 月齡 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠 50 只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。將小鼠置于7:00-19:00 光照和19:00-7:00 黑暗的實驗室，水食不限，飼養環境溫度24℃，濕度為50%-60%。將小鼠隨機分為對照組、放射線照射組（8Gy）、電針組1（1 周）、電針組2（2 周）和電針組3（3 周），每組10 只。本實驗已通過河南中醫藥大學倫理審查，動物倫理審查批準編號為：DWLL16020034。

1.2 主要儀器與試劑

無菌針灸針（0.30 mm ×13.00 mm，蘇州醫療用品廠）；直線加速器（Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA）；圖像分析系統Image-Pro plus6.0（Media Cybemetics Inc.USA，型號41N5100-44800）；石蠟切片機（Leica，型號2235）；曝光檢測系統（Fujifilm，Tokyo，Japan）；兔抗AIF 單克隆抗體（ab32516，abcam，USA）；新物體識別（湖南百眾生物科技有限公司，型號BZ-XX117）；POD 凋亡試劑盒(11684817910，Roche)；兔 抗 caspase-3 多 克 隆 抗 體（TA312442，ORIGENE，USA）。

1.3 造模與干預方法

X 射線照射方法：具體方法參考文獻對放射線照射組、電針組1、電針組2、電針組3 進行造模[7]。按照0.01 ml·g-1劑量給與實驗動物2%戊巴比妥鈉，將實驗動物麻醉，將小鼠俯臥置于放射平臺進行X 線照射，照射劑量為8Gy，射線源距離腦99.5 cm。照射過程持續約10 min。造模結束后第二天進行電針干預，使用小鼠固定器對各組小鼠進行固定，對電針組小鼠按照《實驗針灸學》取穴方法進行針刺[13]，回路1 取百會和風府；回路2取雙側腎俞。用針灸針刺入1mm左右，連接電針儀設置參數[8]，電壓1.5 V，頻率10 Hz，波寬1 ms，針刺時間為30 min/次，每天1 次，依據分組連續針刺1周、2周和3周。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 新物體認知實驗

對照組與放射線照射組于造模后第2天進行新物體認知實驗；電針組1（1周），電針組2（2周），電針組3（3周）分別于針刺7天、14天、21天進行新物體認知實驗，具體方法參考文獻[14-15]。第一天為適應期：將小鼠放入測試箱（40×40×40 cm3）內適應3 min，使其適應測試環境；第二天為訓練期：將完全相同的物體A（OA）和物體B（OB）放入測試箱內一側壁的左右兩端，然后將小鼠背朝物體放入場地內同時保證小鼠與兩物體距離相等，使其自由探索物體3 min。結束立即將小鼠放回到原來的鼠籠內。測試期：在訓練期結束后90 min和24 h分別進行測試。測試時將一個完全不同的物體C（OC）替代物體B，然后將小鼠按照同樣的方法剛入測試箱內，使其探索物體3 min。在訓練期和測試期，分別記錄實驗對象對OA、OB 以及OC 的探索時間。將小鼠對OC 的探索時間記為TN；對OA 的探索時間記為TF，將認知指數（RI，recognition index）RI =［TN/(TF+TN)×100%］作為衡量實驗對象的認知能力的指標。錄像記錄整個實驗過程。

1.4.2 細胞凋亡相關指標的檢測

各組小鼠于新物體認知實驗后取材，制備石蠟切片。采用3.5%水合氯醛，0.01 ml·g-1麻醉動物，打開胸腔暴露心臟，穿刺針刺入左心室后剪開右心耳，用PBS液30 ml 灌注約10 min 直至右心耳流出液體逐漸清亮后改用4%多聚甲醛灌注，牽拉動物四肢有僵硬感或尾巴翹起為灌注成功，斷頭并于冰床上取腦，經4%多聚甲醛固定后常規石蠟包埋，切片（厚約4μm）并貼附于載玻片上，65℃烤箱過夜干燥備用。

（1）TUNEL染色檢測DNA斷裂情況

石蠟切片脫蠟至水，3%蛋白酶K 消化組織，PBS清洗后加入TUNEL 檢測液后室溫下孵育60 min，PBS清洗后加入 POD 轉換劑 37℃下 20 min，PBS 清洗后DAB染色。TUNEL 陽性細胞核染成棕黃色，每張切片選5 個高倍視野觀察記錄，計算凋亡指數[AI=（陽性細胞數/總細胞數）×100%]，計算平均數進行統計。

（2）免疫組化檢測caspase-3 和AIF 細胞凋亡相關指標

圖1 不同療程電針對各組小鼠新物體認知功能的影響（，10只鼠/組）

梯度酒精、二甲苯脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復。山羊血清30 min 封閉非特異性抗原，滴加caspase-3（1∶50）和AIF（1∶50）一抗，PBS 液沖洗后，滴加相對應二抗，室溫下孵育，顯色用DAB 顯色液及ABC Elite 試劑盒。樹膠封片并拍照留存，檢測海馬區免疫陽性細胞的平均光密度值MOD。

1.5 統計學方法

實驗數據采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計分析，新物體認知實驗結果采用重復測量方差分析進行處理，其它實驗結果采用單因素方差分析結合Tukey's兩兩比較進行檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。數據均以均數±標準差（）表示。

2 實驗結果

2.1 不同療程電針對各組小鼠認知功能的影響

本實驗采用新物體認知檢測放射線照射對海馬區認知功能的影響以及不同療程電針干預的作用。具體實驗流程見圖1A。實驗結果表明放射線照射可顯著損傷小鼠新物體認知能力，其中在兩個測試點，與對照組比較，放射線照射組小鼠探索新物體OC 時間均顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.001），而與放射線照射組比較，電針1、2 和3 組小鼠在90 min 時探索新物體時間均顯著增加（P ＜0.05，P ＜0.05，P＜ 0.01），同時在24 h 測試點時探索新物體時間均顯著增加（P＜0.01，P＜ 0.01，P＜ 0.05）；而在24 h 測試點，與對照組比較，放射線照射組小鼠的認知指數明顯下降（P＜0.05），電針1、2 和3 組小鼠認知指數均不同程度升高（P＜0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05）。

2.2 不同療程電針對各組小鼠海馬區神經元凋亡的影響

海馬區被公認為是參與調節認知及學習記憶的中心核團。因此，我們用TUNEL法檢測各組小鼠海馬區神經元凋亡數目，TUNEL 陽性細胞呈深棕色，并可見細胞核固縮，細胞形態不規則，即凋亡細胞。實驗結果顯示與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區神經元凋亡數量顯著升高（P＜0.01），說明隨著放射線照射可誘導小鼠海馬區神經元凋亡。而與放射線照射組比較，電針各組神經元凋亡數量均有所減少，其中電針組2 和電針組3 具有顯著性差異（P＜ 0.01，P＜0.05）；不同電針組比較發現，與電針組1 比較，電針組2 表達明顯增加（P＜ 0.05）；電針組3 與電針組2 比較，差異無統計學意義。實驗結果見圖2。

2.3 不同療程電針對各組小鼠神經元細胞凋亡因子表達的影響

2.3.1 各組小鼠海馬區caspase-3的表達

圖2 不同療程電針對各組小鼠海馬區神經元凋亡的影響（TUNEL法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

圖3 不同療程電針對各組小鼠海馬區caspase-3表達的影響（免疫組織化學法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

各組小鼠海馬區神經元caspase-3 表達檢測結果顯示caspase-3 陽性細胞呈棕褐色，主要表達于細胞質。其中與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區神經元caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）。而與放射線照射組比較，電針組2和電針組3小鼠海馬區caspase-3 表達顯著減少，并存在顯著性差異（P＜ 0.01，P＜0.05）；與電針組 1 比較，電針組 2 表達明顯增加（P＜0.001）；電針組3與電針組2比較，差異無統計學意義。實驗結果見圖3。

2.3.2 各組小鼠海馬區AIF的表達

各組小鼠海馬區神經元AIF 表達檢測結果顯示AIF 蛋白表達陽性細胞呈棕黃色，并且主要表達在細胞核內。實驗結果表明與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區神經元AIF 表達顯著增加（P＜0.001）；而與放射線照射組比較，電針各組小鼠海馬區AIF 表達顯著減少（P＜ 0.001，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；不同電針組比較發現，與電針組1 比較，電針組2 和電針組3 表達顯著增加（P＜ 0.01，P＜ 0.01），電針組2 與電針組3 差異無統計學意義。實驗結果見圖4。這一實驗結果與caspase-3表達結果具有一致性，說明放射線照射可誘導海馬區神經元凋亡，而不同療程的電針干預具有一定的改善作用，其中電針2周和電針3周效果顯著。

圖4 不同療程電針對各組小鼠海馬區AIF表達的影響（免疫組織化學法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

3 討論

學習記憶是大腦的一種高級神經活動，海馬區被認為與空間學習記憶、物體認知和情感恐懼記憶密切相關[16,17]。此外研究發現海馬區對放射線較為敏感[18]，因此有研究認為海馬區是X 射線照射導致行為學改變的關鍵調節區域，海馬區神經元的凋亡、突觸數目的下降、血腦屏障的損傷等可能與腦區放射線照射后的認知及學習記憶功能改變有關[19-21]。本實驗前期行為學檢測發現不同劑量X 射線照射可不同程度損傷小鼠的空間學習記憶功能。在本實驗中我們利用新物體認知實驗檢測不同療程電針干預對放射性腦損傷小鼠認知功能的作用，結果發現電針1 周、2 周和3周均顯著增加小鼠探索新物體時間，并且認知指數較放射線照射小鼠顯著提高。上述實驗結果說明放射線照射損傷了海馬依賴性學習記憶及認知能力，而電針干預可顯著改善放射線照射所導致的認知功能損傷。

細胞凋亡又被稱為細胞程序性死亡，參與調節分化及正常細胞的更新，并與多種疾病密切相關[22-24]。本實驗利用TUNEL 法檢測不同療程電針干預對放射線照射后小鼠海馬區神經元凋亡的影響。實驗結果表明給予放射線照射可誘導神經元凋亡，而電針2 周和3周顯著減少神經元凋亡數量。這一實驗結果與前期行為學結果相符，說明放射線照射所引起的認知功能和學習記憶功能下降與海馬區神經元凋亡所致的海馬區功能受損相關，而電針干預可通過抑制神經元凋亡改善放射線所致的整體認知行為損傷。caspase-3 被認為是細胞凋亡信號通路中的主要效應因子之一，是細胞遭受到各種損傷后啟動凋亡信號通路的執行蛋白，也是研究細胞凋亡的常用指標[24]。caspase-3屬于半胱氨酸蛋白酶家族，直接參與并執行細胞凋亡程序。因此本實驗將其作為檢測指標，實驗結果表明給予放射線照射處理可誘導海馬區神經元內活化caspase-3蛋白表達水平的增加，與對照組比較具有顯著性差異。這一實驗結果說明放射線照射可誘導caspase-3 信號通路介導的神經元凋亡。而給予電針干預后，caspase-3 表達均有所下降，其中電針2 周和3周與放射線照射組比較具有顯著性差異，說明不同療程電針干預可不同程度的抑制caspase-3的表達，從而發揮抗放射線損傷的作用。此外，除了caspase-3參與介導細胞凋亡過程外，線粒體也在其中起到了決定性的作用[25-26]。凋亡誘導因子AIF 是位于線粒體膜間隙的一類黃素蛋白，其不依賴于caspase-3 信號通路直接介導細胞凋亡。研究發現AIF既具有細胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，細胞在受到凋亡的刺激后，AIF 會從線粒體易位到細胞核，并且與細胞核中的染色體結合使其發生凝集斷裂，同時也可破壞細胞骨架蛋白、核蛋白等，最終引起細胞凋亡[27-29]。而在本實驗中，實驗結果發現與對照組比較，給予放射線照射可導致神經元細胞內AIF的表達顯著增加。這一結果表明放射線照射不但可以通過caspase-3 通路誘導細胞凋亡，同時也可以誘導非caspase-3 途徑的AIF 釋放，從而促使神經元凋亡增加、數目減少以及功能受損，最終導致了整體行為學的改變。而給予不同療程電針干預均顯著抑制放射線照射所誘導的AIF表達及神經元凋亡。

綜上所述，不同療程電針干預可通過抑制caspase-3 和AIF 的表達，減少海馬區神經元細胞的凋亡，從而從整體水平改善放射線照射小鼠的認知及學習記憶功能，其中電針2 周及3 周作用效果較顯著。放射性腦損傷是神經系統腫瘤放療后出現的嚴重并發癥之一，其具體發病機制尚不明了[30]。本實驗研究結果提示放射線照射可通過caspase-3 和AIF 兩條途徑誘導小鼠海馬區神經元凋亡，致使神經元細胞數目以及功能均受到損傷，而給予不同療程的電針干預可不同程度的改善上述損傷作用，其中電針2周和電針3周作用最為顯著。因此，在今后的預防和治療放射性腦損傷時，抑制凋亡因子的釋放以及保護線粒體功能具有重要的臨床意義，為臨床合理采用電針防治放射性腦損傷提供了理論依據。