基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大柴胡湯對2型糖尿病的治療作用機制＊

趙 凱，許筱穎

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

近年來，由于分子生物學(xué)以及各種先進的組學(xué)技術(shù)逐漸被應(yīng)用到中醫(yī)藥的領(lǐng)域中，在藥理學(xué)分子作用機制研究和臨床應(yīng)用中已經(jīng)積累了大量的實驗研究數(shù)據(jù)[1]；隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，深度挖掘和整合這些已有的中醫(yī)藥相關(guān)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，可以做到節(jié)約實驗資源，為下一步中醫(yī)藥現(xiàn)代化和新藥研發(fā)提供思路[2]。中醫(yī)復(fù)方往往由幾種至幾十種中草藥組成，每種草藥都包含了幾十種甚至上百種化學(xué)成分，因此由一張中醫(yī)復(fù)方制成的湯劑可能含有成百上千種化合物，不同的組分之間呈現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用。中藥配伍的“七情”理論對不同中藥之間配伍可能出現(xiàn)的不同情況做出了很好的詮釋和歸納，如“相須”和“相使”表明兩種藥物會產(chǎn)生協(xié)同作用而增強療效，“相畏”和“相殺”會產(chǎn)生減毒的效果，如果兩種藥物“相反”則意味著將兩種藥同時使用會產(chǎn)生毒性。從現(xiàn)代藥理學(xué)的角度看“七情”理論，則可以認為是各草藥所含的化學(xué)物組分之間產(chǎn)生了相互作用。由于所含的化合物數(shù)量眾多且相互作用十分復(fù)雜，而通過提取分離的單一活性化合物和中藥復(fù)方的作用效果在實際中又相去甚遠，化合物和中醫(yī)配方之間存在很大的差異；雖然從中藥中提取單體制成的藥物也能取得巨大成功，例如從青蒿中發(fā)現(xiàn)了青蒿素，但是闡明中藥復(fù)方不同組分之間的相互作用及藥理機制仍是十分必要的，只通過傳統(tǒng)藥理學(xué)實驗的方法難以勝任。由于疾病具有復(fù)雜性，一種疾病可能同時涉及多個病理途徑，如內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，一個病理途徑又與多個基因靶點和蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)。如糖尿病從開始胰島功能異常到最終出現(xiàn)各種并發(fā)癥，涉及多種途徑和多個系統(tǒng)，如果僅僅依靠單一成分單一靶點藥物去治療多靶點的疾病是不現(xiàn)實的[3]。

現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過網(wǎng)絡(luò)分析的方法尋找和構(gòu)建藥物與疾病之間多靶點的作用關(guān)系，為闡明中藥復(fù)方的藥理機制和新藥發(fā)現(xiàn)提供了有利途徑[4]；有研究者就曾通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了新的抗癌藥物[5]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法被廣泛引入到中醫(yī)藥領(lǐng)域的藥理及病理的研究和分析中，如通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的梔子大黃湯治療肝病的網(wǎng)絡(luò)模型，找到了多個潛在的作用靶點及相應(yīng)化合物[6]；通過結(jié)合基因、蛋白質(zhì)等測序?qū)嶒灁?shù)據(jù)，對芪參益氣方構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型進行分析，發(fā)現(xiàn)全方配伍使用的療效高于其中任何單一使用的藥味[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與中醫(yī)“整體觀”“辨證論治”的思想不謀而合[8]，搭建起了傳統(tǒng)中醫(yī)藥和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之間溝通的橋梁[9]，網(wǎng)絡(luò)上開放獲取的中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫和多種組學(xué)數(shù)據(jù)庫，極大促進了多靶點藥物疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析的便捷性。

糖尿病是我國常見的慢性代謝性疾病，據(jù)統(tǒng)計中國的糖尿病患者有1.14 億之多，又因為我國人口基數(shù)巨大，伴隨社會的逐漸老齡化趨勢，使我國成為了世界上的糖尿病大國，糖尿病防治成為了亟待解決的重大民生問題，如何有效防治糖尿病在當今仍然是醫(yī)學(xué)難題[10,11]。臨床上主要多見2 型糖尿病（Type 2 diabetes），2 型糖尿病大約占到了90%左右，除2 型糖尿病之外，還有1型糖尿病，特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病[12,13]。中醫(yī)復(fù)方具有“多組分、多靶點、多作用途徑”的特點以及中醫(yī)診療的整體觀和辨證論治思想，中醫(yī)藥在治療糖尿病方面有獨到之處，值得深入研究和挖掘。有研究者曾運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了葛根芩連湯治療糖尿病的分子網(wǎng)絡(luò)作用機制，并用實驗進一步驗證了其中的關(guān)鍵活性成分[14]。中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》是中醫(yī)辨證論治思想的源頭，具有極高的學(xué)術(shù)地位，被歷代名家奉為圭臬。大柴胡湯是《傷寒論》中一首著名方劑，為小柴胡湯去人參加枳實、芍藥、大黃而成，去掉了人參之補，增加了宣通之力，主要功效是用于治療少陽和陽明合病，有和解少陽、內(nèi)瀉里熱的作用。近年來，大柴胡湯的臨床應(yīng)用得到了擴展和深化，廣泛用于治療胃腸道等消化系統(tǒng)疾病，并且對糖尿病及其并發(fā)癥和高脂血癥方面也有很好的效果[15]。有臨床研究表明，大柴胡湯治療超重2 型糖尿病與西藥二甲雙胍有類似的療效[16]。大柴胡湯改善了糖尿病患者的癥狀，降低了血糖和血脂等指標，值得臨床推廣使用[17]。由于大柴胡湯藥效成分復(fù)雜，其對糖尿病治療作用的分子機制仍不是很清楚。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法直觀的分析大柴胡湯復(fù)方的作用機制，系統(tǒng)闡釋和挖掘中醫(yī)經(jīng)典方劑大柴胡湯對2 型糖尿病的治療作用機理，以期為進一步的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯和2型糖尿病潛在靶點檢索

首先將大柴胡湯中的8味中藥：柴胡、黃芩、白芍、半夏、枳實、生姜、大棗、大黃依次輸入中醫(yī)藥生物信息分析平臺SymMap[18]（https://www.symmap.org/search/），得到預(yù)測的大柴胡湯的有效化學(xué)成分和靶標，將大柴胡湯中的每味藥分別依次輸入到平臺中，設(shè)置搜索條件為P＜0.05。通過在CTD 數(shù)據(jù)庫[19]（Comparative Toxicogenomics Database, www. ctdbase. org）中 搜 索“Diabetes Mellitus,Type 2”，即可獲得預(yù)測出的2 型糖尿病有關(guān)的靶點，將其導(dǎo)入到Excel 表格中按“Inference Score”從高到低排序，保留具有直接證據(jù)的靶點。

1.2 藥物-疾病靶點篩選

通過預(yù)測獲得大柴胡湯的所有潛在靶點和2型糖尿病的相關(guān)靶點，將兩組數(shù)據(jù)分別輸入到韋恩圖繪制工具[20]（Calculate and draw custom Venn diagrams,http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件中，即得到大柴胡湯和2 型糖尿病的重疊作用靶標，即為得到的藥物-疾病靶點。

1.3 藥物-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述篩選出的大柴胡湯和2型糖尿病的共同作用靶點利用STRING（Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis，www.string-db.org），構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）。使用Cytoscape軟件[21]中的cytoHubba 插件[22]按照拓撲學(xué)規(guī)則計算關(guān)鍵節(jié)點，按照節(jié)點度Degree 排序得出PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前10的關(guān)鍵節(jié)點。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用Cytoscape軟件中的CluGO[23]工具對上述得出的大柴胡湯和2 型糖尿病的靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析是一種廣泛使用的基因功能注釋系統(tǒng)，而KEGG（京都基因與基因組百科全書）是基于基因組測序和大分子數(shù)據(jù)集生成的高通量技術(shù)數(shù)據(jù)庫資源。通過富集分析，可以找到大柴胡湯治療2型糖尿病的主要潛在生物學(xué)過程及作用信號通路。

2 結(jié)果

2.1 大柴胡湯治療糖尿病作用靶點

通過在數(shù)據(jù)庫上搜索結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)大柴胡湯中8味藥物的全部潛在靶點有476 個，檢索到2型糖尿病的潛在靶點共有229 個。將大柴胡湯靶點和2 型糖尿病靶點取交集，發(fā)現(xiàn)存在41 個共同作用靶點，即INPPL1、PAM、HMOX1、HNF1A、NOS2、INS、PTPN1、PPARA、CYP1A2、PRKCB等等（圖1）。

2.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選

通過STRING 對41 個大柴胡湯和2 型糖尿病的共同靶點進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，PPI 富集P值小于1.0e-16，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。此PPI 共產(chǎn)生了41 個靶點和270 條邊，平均節(jié)點度（average node degree）為13.2，平均聚類系數(shù)為0.696，PPI 網(wǎng)絡(luò)富集的P＜1.0e - 16，既具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。STING數(shù)據(jù)庫可以揭示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，圓形節(jié)點表示每個已知的由基因編碼的蛋白質(zhì)，節(jié)點之間的邊表示兩者的關(guān)系。邊的不同顏色代表相互作用的證據(jù)類型，如來自實驗的證據(jù)或者文獻證據(jù)，邊的顏色越多說明獲得支持的證據(jù)越多。用degree（度中心性）表示某個節(jié)點與該網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點的連接數(shù)，degree 越高說明該節(jié)點與其他靶點之間的相互作用越廣泛。對構(gòu)建出的互作網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 軟件中的cytoHubba 進行分析，按節(jié)點度Degree 進行排序發(fā)現(xiàn)排名前10 個關(guān)鍵節(jié)點為INS（胰島素）、TNF（腫瘤壞死因子）、CAT（過氧化氫酶）、PPARG（過氧化物酶體增殖物激活受體r）、CASP3（caspase-3）、ADIPOQ（脂聯(lián)素）、NOS3（一氧化氮合酶3），HMOX1(血紅素加氧酶 1)、UCP2（解偶聯(lián)蛋白酶2）、GCG（胰高血糖素），節(jié)點顏色越深表明排名越靠前，節(jié)點越大表明節(jié)點度越高（圖3）。

2.3 藥物-疾病作用靶點GO功能分析

使用CluGO工具對此41個靶點進行GO生物過程功能富集分析，為了得到更精確的結(jié)果，設(shè)置Kappa Score 為0.4，選擇設(shè)置P值小于0.01，合并相似的GO術(shù)語，最終共獲得79 個生物過程功能富集，并按照Kappa 值分為了12 類（表1）。涉及的生物過程包括：小分子代謝過程的正調(diào)控、凋亡信號通路的負調(diào)控、對維生素的反應(yīng)、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、對生物堿的反應(yīng)、細胞排毒、對尼古丁的反應(yīng)、葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運、死亡域受體的信號通路、外在凋亡的負調(diào)控、調(diào)節(jié)胰島素分泌、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素受體信號通路的調(diào)節(jié)。其中涉及到多個與糖尿病相關(guān)的生物學(xué)過程。

圖1 大柴胡湯-2型糖尿病的共同作用靶點預(yù)測

圖2 大柴胡湯-2型糖尿病共同作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中前10個關(guān)鍵節(jié)點

2.4 藥物-疾病作用靶點KEGG通路富集分析

運用CluGO 工具對41 個作用靶點進行KEGG 信號通路富集分析，設(shè)置Kappa 值為0.4，設(shè)置P值小于0.01，共獲得個41條信號通路的富集結(jié)果，按照Kappa值劃分為了7類（圖7）。這些信號通路主要涉及了：胰島素抵抗、長壽調(diào)節(jié)途徑、青少年的成年人型糖尿病、碳水化合物的消化吸收、2型糖尿病、胰島素信號通路和PPAR 信號通路（表2）。可知其中包含了多個與2型糖尿病的相關(guān)信號通路。除了7條主要的信號通路外，其他還參與了胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、AMPK 信號通路、NF-κB 信號通路、鞘脂信號通路、p53 信號通路、細胞凋亡、RIG-I 樣受體信號通路、IL-17 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路等（圖6）。

2.5 大柴胡湯治療2型糖尿病的活性化學(xué)成分篩選

通過在TCM-BATMAN[24]數(shù)據(jù)庫中檢索大柴胡湯中的藥物共得到活性成分474 個，其中柴胡有82 個化學(xué)成分，黃芩有65 個化學(xué)成分，白芍有35 個化學(xué)成分，半夏有31 個化學(xué)成分，大黃有58 個化學(xué)成分，大棗有49 個化學(xué)成分，生姜有133 個，枳實有21 個。胰島素抵抗（Insulin resistance）、2 型糖尿病（Type 2 diabetes）、胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）是3 條大柴胡湯治療糖尿病主要參與的信號通路（表2），進而繪制出這3 條主要信號通路上的靶點（圖9）。這些靶點在大柴胡湯中所對應(yīng)的各活性化學(xué)成分（圖10）和大柴胡湯8 味草藥中與參與上述3 條信號通路所對應(yīng)的主要活性化學(xué)成分（圖8、表3）。

3 討論

圖4 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點GO生物過程富集分析

圖5 GO生物過程富集分析各部分所占比例

糖尿病是一種以高血糖為特征的內(nèi)分泌疾病，主要由胰島素分泌缺乏引起。胰島素是一種重要的內(nèi)分泌激素，胰島素分泌以及胰島功能失常還有可能伴隨或引起其他內(nèi)分泌激素分泌的失調(diào)[25]。本研究通過SymMap 和CTD 疾病數(shù)據(jù)庫篩選出大柴胡湯中存在多個對2 型糖尿病直接作用的靶標，并且從PPI 網(wǎng)絡(luò)計算得知，節(jié)點度最高的是編碼胰島素的靶點INS（胰島素）；在GO 功能分析中，也顯示大柴胡湯參與了葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)胰島素分泌、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素受體信號通路的調(diào)節(jié)等生物過程；通過KEGG富集分析，可以看出大柴胡湯的作用靶點直接參與調(diào)控了胰島素抵抗、2 型糖尿病、胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等與2型糖尿病的發(fā)病機制直接密切相關(guān)的信號通路。說明了大柴胡湯治療糖尿病的分子生物學(xué)機制可能是直接參與了對胰島素的分泌調(diào)控，從而調(diào)節(jié)血糖。有臨床研究顯示，大柴胡湯能明顯降低2 型糖尿病患者的血糖[26]，改善?細胞功能，減輕胰島素抵抗[27]，增加對血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[28]。從圖8 中可以發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯治療2型糖尿病的活性化學(xué)成分主要集中在柴胡、半夏、生姜、白芍和大黃五味草藥中。從圖9中可以看出，在3 條主要的通路上又以在胰島素抵抗（Insulin resistance）這條通路上富集的靶點最多。從圖10的大柴胡湯成分靶點網(wǎng)絡(luò)中可以得出，與INS、TNF 和PRKCB 3 個靶點相關(guān)聯(lián)的大柴胡湯中的化學(xué)成分最多。

圖6 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)KEGG信號通路富集分析

圖7 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點網(wǎng)絡(luò)的主要信號通路各部分比例

表2 大柴胡湯對2型糖尿病治療靶點KEGG信號通路富集分析

圖8 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（1）

大柴胡湯君藥為柴胡，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“柴胡，主心腹，去腸胃中結(jié)氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”，柴胡的功效與大柴胡湯的功效基本一致。大柴胡湯主治病邪在少陽不解兼入陽明，化燥成實而出現(xiàn)嘔不止、心下急、郁郁微煩等癥，既能夠清解郁熱，又能下陽明里實，為表里雙解之劑；糖尿病在中醫(yī)學(xué)被稱為“消渴”，多認為是由于飲食不節(jié)和情志失調(diào)導(dǎo)致，治療常以滋陰清熱為主，大柴胡湯能疏轉(zhuǎn)少陽樞機，開達少陽之郁，故能顯效。有中醫(yī)學(xué)者認為，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義的糖尿病不能與我國古代的“消渴”證完全對應(yīng)，不是所有的糖尿病患者都會出現(xiàn)“消渴”的三多癥，而應(yīng)該針對具體病癥具體分析[29]，現(xiàn)代人多嗜食肥甘厚膩，如臨床上糖尿病患者常伴有高血脂和肥胖，中醫(yī)辨證多為氣滯痰濁血瘀體質(zhì)，有的患者還會伴有易怒急躁或抑郁等情志異常表現(xiàn)，這些基本病機形成了糖尿病發(fā)病的土壤。大柴胡湯能疏暢三焦氣機，化濁通腑，有專家用大柴胡湯來治療包括糖尿病、肥胖、高血壓、高血脂等多種代謝性疾病[30]。這些疾病都存在氣滯和膏濁內(nèi)蘊的相似病機，中醫(yī)的病機理論和中醫(yī)所認為的疾病背后的本質(zhì)可能和現(xiàn)代分子生物學(xué)機制存在一定聯(lián)系[31]，正如本文通過分析大柴胡湯治療糖尿病的通路機制，發(fā)現(xiàn)其能直接參與調(diào)控胰島素的分泌及其相關(guān)的多條信號通路。通過上述預(yù)測篩選出的靶點和通路機制很可能是在大柴胡湯治療糖尿病發(fā)揮療效的過程中起著非常重要的作用。

表3 大柴胡湯治療2型糖尿病主要活性化學(xué)成分

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對大柴胡湯治療2 型糖尿病的作用靶點和通路進行了預(yù)測篩選和分析，與以往的研究結(jié)果相互印證，為進一步的實驗研究提供了參考方向和理論基礎(chǔ)。初步揭示了大柴胡湯作用于2 型糖尿病的多靶點、多機制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機制。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫的局限性，還不能完全表達中醫(yī)復(fù)方有效成分相關(guān)作用機制，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果仍需后續(xù)體內(nèi)體外實驗的觀察與驗證。

圖9 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（2）

圖10 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（3）