基于網絡藥理學方法探討八珍湯治療ITP的作用機制＊

姜云耀，劉 楠，胡曉梅，侯金才，劉建勛＊＊

（1. 清華大學藥學院中藥研究院 北京 100084；2. 北京盈科瑞藥物安全有效性研究有限公司 北京 102206；3. 中國中醫科學院西苑醫院 北京 100091；4. 京津冀聯創藥物研究（北京）有限公司 北京 100083）

原發免疫性血小板減少癥（Primary immune thrombocytopenia，ITP）以前又被稱為“特發性血小板減少性紫癜”。導致血小板減少的原因有很多，機體對自身血小板抗原免疫失耐受是主要原因之一，也是ITP 發生的主要原因。骨髓巨核細胞成熟障礙是ITP發生的最常見表現，臨床上也多表現出皮膚、黏膜、內臟出血等癥狀，嚴重時可以直接危及到生命。目前，西方醫學尚未發現十分有效的ITP 治療方法，現有方法十分局限，且伴有較大的副作用。中醫藥治療ITP具有獨特優勢，因此應當加快相關研究進展。中藥八珍湯由人參、當歸、茯苓、甘草、川芎、白術、熟地黃、白芍8味藥材組成，具有益氣補血的功效，主治氣血兩虛證，在臨床上主要用于氣不攝血型ITP 的治療。金小洣[1]發現以益氣補血、養陰生精、涼血止血為法治療ITP 療效顯著，并用加味八珍湯治愈ITP，愈后隨訪未見復發。文鴻光等[2]以加味八珍湯聯合小劑量醋酸潑尼松片的方法治療ITP，明顯提高了患者血小板計數，顯著提高了臨床療效，并改善患者的生活質量。熊春琦[3]用八珍湯加味聯合激素成功治愈了36 例ITP 患者。八珍湯既有補氣又有補血的功效，研究表明八珍湯治療ITP 與抑制血小板聚集、增強機體造血功能和調節免疫功能等密切相關。但目前尚未有八珍湯治療ITP作用機制的相關報道。

中藥方劑在中國具有數千年的應用歷史，是中醫整體觀的體現，具有配伍的特點。隨著近年來對中藥方劑研究的不斷深入，其復雜的化學體系與機體復雜生物系統的相互作用成為當前研究的重要課題[4]。生物網絡及多靶點的干預方法符合中藥方劑的作用特點，運用網絡與系統的思想有助于對方劑復雜的化學體系和作用機制進行理解。因此，從生物網絡調控的角度揭示中藥方劑的作用奧秘，既符合中藥作用的整體理論，又符合中醫藥現代化研究的研究思路[5]。為了從系統角度和分子水平闡明中藥，研究者建立了“網絡靶標，多成分”模式的中藥網絡藥理學方法，預測中藥的靶點和藥理作用，解釋中藥方劑的配伍規則和網絡調節作用[6]。

本研究運用網絡藥理學的方法從分子水平上闡述八珍湯化學成分與成分之間、成分與靶點之間、靶點與疾病之間的潛在聯系，探索成分、靶點、蛋白質和疾病之間的相互作用關系[7]，從而探討八珍湯治療ITP的作用機制，為進一步明確ITP 的發生機制及八珍湯治療ITP的相關機理提供理論基礎。

1 材料

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]；Drugbank 數據庫（https://www.drugbank.ca/）[9]；Cytoscape 3.7.1 軟 件[10]；OMIM 數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man）；TTD 數據庫（Therapeutic Targets Database）[11]；GAD 數 據 庫（Genetic Association Database）；GeneCards 數據庫[12]；STRING 數據庫 ；DAVID 數據庫（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）[13]；KEGG 數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[14]；Omicshare。

2 方法

2.1 八珍湯化學成分篩選和靶點預測

中藥八珍湯由人參、熟地黃、當歸、甘草、川芎、白術、白芍、茯苓8 味藥組成。參照劉楠等[15]的方法，通過TCMSP 數據庫和國內外文獻研究收集上述8 味中藥的主要化學成分，同時設定口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）等相關參數對收集到的八珍湯的主要化學成分進行篩選。根據文獻報道，參數設定條件為OB ≥30%和DL ≥0.18[16]，篩選符合條件的化學成分，既而選取來源于Drugbank 數據庫的化學成分作用靶點信息，同時剔除非人源靶點。一些化合物如益母草苷、梓醇、阿魏酸、藁本內酯、洋川芎內酯I等雖然不滿足篩選條件，但是通過查閱文獻可知這些化合物在治療ITP 方面具有相關活性，所以將這些不滿足篩選條件的化合物也一并作為候選成分納入分析[17]。在設定OB、DL 作為篩選條件的基礎上又通過文獻查找的方式收集八珍湯化學成分，使得結果更全面。

2.2 ITP相關靶點獲取

ITP 的英文名稱有 primary immune thrombocytopenia、idiopathic thrombocytopenic purpura、immune thrombocytopenic purpura 和 primary thrombocytopenic purpura。因此，以上述英文名稱為關鍵詞分別在OMIM數據庫、TTD數據庫、GAD數據庫和GeneCards數據庫查找ITP的相關靶點。

2.3 八珍湯治療ITP的相關靶點獲取

為了闡述八珍湯治療ITP 的作用機制，本文將八珍湯的作用靶點與預測得到的ITP 作用靶點進行合并取其交集，共有靶點即認為是八珍湯治療ITP 的相關靶點。然后將獲取的靶點上傳到STRING 數據庫，構建蛋白質相互作用網絡，分析核心靶點。

2.4 八珍湯治療ITP的相關靶點富集分析

本文利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對八珍湯治療ITP 的相關靶點進行基因本體（GO）富集分析，選擇生物過程（biological process），設置P≤0.01。通過DAVID 在線分析工具實現對靶點的KEGG生物通路富集分析。通過KEGG數據尋找富集出來的生物通路，借助Omicshare獲取的KEGG生物通路富集分析結果繪制成氣泡圖。

3 結果

3.1 八珍湯化學成分的收集與篩選

利用 TCMSP 數據庫，以 OB ≥30% 和 DL ≥ 0.18 為篩選條件從八珍湯各組成藥味中收集到了160個化合物。其中甘草的化學成分最多，有92個；人參次之，有22 個成分；茯苓有15 個成分；白芍有13 個成分；白術有7個成分；川芎有7個成分；當歸有2個成分；熟地黃有2 個成分。除上述成分之外，基于文獻研究我們了解到還有9 個化學成分具有廣泛藥理活性，但因不滿足OB 和DL 的篩選條件未被納入，此次也將它們作為候選化合物納入研究。例如阿魏酸在血小板聚集和血栓形成等方面具有顯著效果，同時還表現出了抗氧化、抗炎以及免疫調節等作用[18]。藁本內酯在抗炎和免疫調節等方面也表現出了很好的藥理作用[19]。因此，共篩選得到169個八珍湯所含的化學成分，其中白芍 14 個、人參 23 個、甘草 92 個、茯苓 15 個、白術 7 個、川芎7 個、當歸6 個、熟地黃5 個。刪除重復后共獲得159個成分。

3.2 靶點預測

利用TCMSP 分析平臺，對從八珍湯中篩選出的159 個化合物進行來源于Drugbank 數據庫的靶點預測，其中芍藥苷、黃甘草苷、苯甲酰芍藥苷等28個化合物在該數據庫中沒有靶點。總共獲得了八珍湯中131個化合物的靶點，靶點總數為1823 個。其中，白芍99個、人參 204 個、甘草 1272 個、茯苓 28 個、白術 20 個、川芎36 個、當歸106 個、熟地黃58 個。去除重復后總共得到146個靶點。

3.3 成分-靶點網絡構建與分析

以八珍湯中篩選出的化合物和靶點為基礎建立成分-靶點網絡圖（圖1）。該網絡包含277 個節點和1823條邊，131個化合物的網絡節點度中位數為11，表明大多數化合物影響多個靶點。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的網絡節點度分別為118、87、84和70，它們在網絡中處于核心位置。因此，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是八珍湯關鍵的多效活性成分。

3.4 ITP相關靶點

以ITP 各英文名稱為關鍵詞分別在OMIM 數據庫、TTD 數據庫、GAD 數據庫和 GeneCards 數據庫中進行搜索，在OMIM 數據庫中查找到6 個ITP 相關靶點，在 TTD 數據庫中查找到 4 個 ITP 相關靶點，在 GAD 數據庫中查找到18 個ITP 相關靶點，在GeneCards 數據庫中查找到303 個ITP 相關靶點，刪除重復后總共得到306個ITP相關靶點（圖2）。

圖1 八珍湯的成分-預測靶點網絡

3.5 八珍湯治療ITP的相關靶點

將八珍湯的作用靶點與預測得到的ITP 作用靶點進行合并取其交集后共獲得21個靶點，分別為BCL2、CCL2、F3、F7、HMGCR、IFNG、IGHG1、IL1B、IL2、IL6、KDR、MPO、NOS3、NR3C1、PLAT、PPARG、PTGS2、PTGS2、SELE、THBD、TNF、VEGFA（圖3）。

3.6 八珍湯治療ITP相關靶點的富集分析

為了進一步闡述八珍湯治療ITP 的作用機制，本文利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對八珍湯治療ITP 的相關靶點進行生物過程的富集分析。以P＜0.01 為條件進行篩選，富集到114 個生物過程（圖4）。圖中每個圓點都代表一個生物過程，用圓點大小表示P值的大小，圓點越大說明P值越小。其中positive regulation of vitamin metabolic process、positive regulation of endocytosis、regulation of endothelial cell proliferation、positive regulation of leukocyte cell-cell adhesion 和response to glucocorticoid 富集程度顯著。應用DAVID 分析工具對相關靶點進行KEGG 富集分析，篩選得到P＜0.05 的 KEGG 通路 34 條，選擇前 20 條通路構建氣泡圖（圖5）。圖中圓點的顏色和大小反映了與通路相關聯的基因數量及P值，P值越小顏色越偏于紅色，相關聯基因的數量越多圓點則越大。結果顯示，八珍湯治療ITP 的機制主要涉及TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway 和 VEGF signaling pathway 等 通 路 。八珍湯治療ITP 相關靶點的蛋白質相互作用網絡（圖6）中紅色的點為TNF信號通路相關的靶點。

4 討論

圖2 ITP相關靶點網絡圖

圖4 八珍湯治療ITP候選靶點的GO富集

ITP 是最常見的自身免疫性血細胞減少癥，其特征在于短暫或持續減少的血小板計數[20,21]。ITP 的發生源于抗血小板自身抗體的產生導致網狀內皮系統特別是脾中的血小板破壞[22]。ITP患者伴有瘀傷，皮膚出血和不常發生的嚴重出血（包括顱內出血）[23]。此外，ITP 患者的生活質量因身體癥狀、心理癥狀、恐懼、社交活動減少和工作能力下降而惡化[24]。新診斷的ITP 患者的標準療法是止血和通過藥物增加血小板計數，但這些藥物往往具有嚴重的副作用[25]。考慮到高昂的治療費用，ITP 患者將面臨巨大的經濟負擔，特別是患有嚴重疾病的患者[26]。從中醫理論解釋，ITP是一種因脾不統血而引起血溢脈外的疾病，臨床表現為血熱妄行、氣不攝血、陽虛火旺、瘀血阻絡等，治療方法一般包括清熱涼血、健脾益氣、滋陰清熱、活血通絡等[27]。八珍湯、歸脾湯等中藥是中醫臨床治療ITP 的常用方劑。八珍湯具有氣血雙補的功效，研究表明八珍湯具有抑制血小板聚集、增強機體造血功能的作用，并可以通過調節免疫功能發揮治療ITP的作用[28]。

本研究運用網絡藥理學的方法探討八珍湯治療ITP的可能作用機制。首先通過TCMSP數據庫和文獻報道從八珍湯配伍中藥人參、茯苓、白術、甘草、當歸、川芎、白芍和熟地黃中總共篩選出159 個化學成分進行靶點預測分析，總共得到146 個靶點。TCMSP 數據庫是中藥網絡藥理學研究中常用的工具之一，其獨特優勢在于可通過ADME 參數對中草藥所含化學成分進行篩選，提高結果的準確性。但也有一定的局限性，如在以OB 和DL 為條件進行成分篩選時，一些被納入的成分在治療相關疾病方面可能不具有相關活性，而還有一些具有相關藥理作用的成分由于不滿足篩選條件而沒有被納入，這時就應該通過查閱文獻的方式手動將這些成分納入。在本研究中阿魏酸、藁本內酯等9個化合物即為具有相關藥理活性但不滿足篩選條件而手動納入的成分。在八珍湯的作用靶點分析中，雖然預測得到的各化學成分靶點數量不同，但有些成分靶點的重疊程度卻很大，也就是說八珍湯中的各成分具有共同或相似的靶點，起到協同增效的作用。在成分-靶點網絡，八珍湯的131個化合物的網絡節點度中位數為11，說明大多數化合物都具有多重靶點。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的網絡節點度最高，它們在網絡中處于核心位置。因此，它們可能是八珍湯關鍵的多效活性成分。

圖5 八珍湯治療ITP候選靶點的KEGG通路富集

圖6 八珍湯治療ITP相關靶點的蛋白質相互作用網絡

為了揭示八珍湯治療ITP 的作用機制，將八珍湯作用靶點與ITP 相關靶點進行合并取其交集，即為八珍湯治療ITP 的相關靶點。通過對八珍湯治療ITP 相關靶點的基因功能和KEGG 生物通路的富集分析，得到八珍湯治療ITP相關靶點主要涉及的生物過程和相關生物通路的信息。八珍湯治療ITP主要涉及內吞作用的正調控、內皮細胞增殖的調控、白細胞粘附的正調控、維生素代謝過程的正調控和糖皮質激素的應答等生物過程，在生物通路方面主要包括TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路等。此外，單純性皰疹感染、麻疹、Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路等也被顯著富集。盧檸[29]的研究發現，ITP 患者外周血中的TNF-α明顯高于正常組，在經過治療后TNF-α顯著下降，說明TNF-α參與了ITP 的發病機制。據文獻報道，皰疹類病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、人類微小病毒B19 等也與ITP 的發生具有密切關聯[30]。王藝超等[31]對ITP 患者和正常人的脾巨噬細胞通過高通量基因芯片技術進行基因表達的分析，并對患者的差異表達基因進行生物通路分析，研究結果顯示Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體通路等為主要通路。張雪皎[32]通過對ITP 患者細胞因子的研究發現，趨化因子信號通路JAK-STAT 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路的改變與疾病的發生有關。徐顏美[33]對漢族人群ITP 患者進行了全基因組關聯的研究，結果發現JAK-STAT信號通路、癌癥通路等與ITP 的發生有關。隨濤等[34]通過篩選ITP 患者血漿差異microRNA，并對靶基因進行富集分析發現，ITP 與鈣離子信號通路、MAPK 信號通路、GnRH 信號通路等密切相關。曾艷等[35]通過對比研究ITP 患者和健康人Treg 細胞microRNA 的表達，發現ITP 與MAPK 信號通路、代謝通路、鈣離子信號通路和T 細胞受體通路等相關。在八珍湯治療ITP 相關靶點的蛋白質相互作用網絡中，TNF、IL6、SELE、CCL2、IL1B 和PTGS2 這6 個TNF 信號通路相關靶點在網絡中處于核心位置，說明TNF 信號通路可能是八珍湯治療ITP的關鍵機制。

本研究利用網絡藥理學的方法研究八珍湯治療ITP 的作用機制，發現八珍湯可能通過內吞作用的正調控、內皮細胞增殖的調控、白細胞粘附的正調控、維生素代謝過程的正調控和糖皮質激素的應答等生物過程發揮治療ITP 的作用；其作用機制可能與TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、Toll樣受體信號通路癌癥通路、T 細胞受體信號通路和VEGF 信號通路等有關，其中TNF 信號通路可能是八珍湯治療ITP 的關鍵機制。在八珍湯眾多化學成分之中，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是其發揮治療ITP作用的關鍵多效活性成分。