揮發(fā)油類中藥主要化學(xué)成分安全性預(yù)測(cè)研究＊

馮小龍

（石家莊學(xué)院化工學(xué)院 石家莊 050035）

中藥在中華民族幾千年的疾病抗?fàn)幨飞习l(fā)揮著不可替代的作用，對(duì)中華民族的繁榮昌盛有著巨大貢獻(xiàn)，并逐漸為歐美國(guó)家關(guān)注，在國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)和食品保健用品市場(chǎng)上銷量不斷上升。隨著我國(guó)醫(yī)藥衛(wèi)生健康產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展，中藥在臨床治療和養(yǎng)生保健方面的地位迅速攀升，但近年來隨著中藥應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，中藥中毒事件、中藥藥源性肝損傷等不良反應(yīng)事件[1]時(shí)有報(bào)道，人們對(duì)中藥的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑，否定中醫(yī)藥和蔑視中醫(yī)藥的聲音時(shí)有發(fā)出，對(duì)中藥的臨床應(yīng)用、中藥現(xiàn)代化與國(guó)際化均造成了較大影響。因此對(duì)中藥安全性進(jìn)行多方面研究，加深對(duì)中藥特性的了解，對(duì)促進(jìn)我國(guó)中藥事業(yè)的健康發(fā)展，加快中藥現(xiàn)代化國(guó)際化進(jìn)程有著重要意義。

含揮發(fā)油類成分的中藥品種較多，現(xiàn)行2015 版《中國(guó)藥典》中收錄618 種中藥中有196 種含有揮發(fā)油類成分，其中37種以揮發(fā)油含量作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。揮發(fā)油類成分是很多中藥的主要藥效成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、促進(jìn)藥物吸收等生物活性，在臨床上應(yīng)用非常廣泛，常用于心腦血管、中樞神經(jīng)、呼吸、胃腸道系統(tǒng)等疾病的治療。隨著臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油類成分在發(fā)揮治療作用的同時(shí)具有毒性，認(rèn)為中藥揮發(fā)油類成分是引起毒性反應(yīng)的重要物質(zhì)之一[3]，如常用中藥薄荷揮發(fā)油，大劑量服用可致中毒[4]，柴胡揮發(fā)油可致肝細(xì)胞損傷[5]，由薄荷油和藏茴香油組成分在研中藥新藥，II 期臨床研究中發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致肝功能輕度異常[6]。

中藥安全性一直是中醫(yī)藥研究的短板，法規(guī)和技術(shù)等因素均影響了我們對(duì)中藥的認(rèn)識(shí)。從藥物研發(fā)法規(guī)來看，我國(guó)對(duì)中藥安全性研究的起步較晚，如中藥遺傳毒性研究，在20 世紀(jì)70 年代以后逐步得到重視。1985 年開始實(shí)施的《新藥審批辦法》中規(guī)定了對(duì)新藥的特殊毒理學(xué)研究要求。但與其他國(guó)家的要求相比較，我國(guó)對(duì)中藥的特殊毒理學(xué)評(píng)價(jià)要求相對(duì)較低，直到2007 年版藥品注冊(cè)管理辦法才提出具體要求，對(duì)于創(chuàng)新程度較高及用于育齡人群并可能對(duì)生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響的新藥應(yīng)報(bào)送遺傳毒性資料，對(duì)其它類別的中藥仍無規(guī)定，但中藥成分具有致突變性作用時(shí)有報(bào)道，如吳茱萸醇提取物無遺傳毒性，但吳茱萸次堿和檸檬苦素有致突變性，可使細(xì)胞染色體畸變率增加；細(xì)辛水煎液能明顯誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核和小鼠精子畸形，具有致突變作用等[7]。從技術(shù)角度分析，由于揮發(fā)油類成分復(fù)雜、性質(zhì)不穩(wěn)定，分離提純困難，采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行毒理學(xué)研究需花費(fèi)大量時(shí)間、物力，因此目前對(duì)揮發(fā)油類成分的毒理學(xué)研究資料較少，認(rèn)識(shí)尚不充分，已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道中試驗(yàn)樣品多采用含復(fù)雜成分的粗提物[8,9]，得出的結(jié)論簡(jiǎn)單，影響臨床應(yīng)用。為了正確認(rèn)識(shí)揮發(fā)油類成分的毒性特點(diǎn)，急需采用新技術(shù)新方法，加強(qiáng)對(duì)中藥揮發(fā)油類成分安全性的多方面研究[10]，明確毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，以指導(dǎo)臨床合理用藥及新藥研發(fā)。

定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）[11]法通過化合物分子本身的特征，計(jì)算分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的參數(shù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法或者機(jī)器學(xué)習(xí)算法，建立分子結(jié)構(gòu)參數(shù)與毒性終點(diǎn)關(guān)系模型，以預(yù)測(cè)未知化合物的毒性，在合成藥物及中藥安全性評(píng)價(jià)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，此方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量化學(xué)成分的安全性全面分析，可用于含有復(fù)雜化學(xué)成分的中藥提取物的研究。通過收集中藥成分毒性數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了兩軟件中肝毒性、急性毒性、雌激素受體作用以及CYP 抑 制 模 型 ，證 明 ADMET Predictor 與 Virtual Tox Lab 均可應(yīng)用于中藥成分預(yù)測(cè)[12]；采用QSAR 模型對(duì)1692 個(gè)中藥化學(xué)成分進(jìn)行急性毒性預(yù)測(cè)研究，證明了結(jié)果具有參考意義[13]；采用多元線性QSAR 模型對(duì)黃酮類化學(xué)成分調(diào)節(jié)P-糖蛋白功能作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高[14]。QSAR 法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)成分毒理學(xué)的快速全面分析，符合毒理學(xué)研究3R 趨勢(shì)，可替代常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并可以彌補(bǔ)中藥化學(xué)成分單體難以獲得無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的不足，還可避免采用粗提物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而得出中藥有毒性的片面性結(jié)論，為中藥安全性評(píng)價(jià)提供新的途徑和方法。

本研究主要采用QSAR 法，對(duì)收集的中藥揮發(fā)油類主要化學(xué)成分進(jìn)行全面的潛在毒性分析，同時(shí)結(jié)合已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥揮發(fā)油類成分的安全性的全面認(rèn)識(shí)，明確毒性與化學(xué)成分之間的關(guān)系，彌補(bǔ)采用粗提物進(jìn)行毒理研究時(shí)毒性成分定性不準(zhǔn)確的不足，同時(shí)可部分替代傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，節(jié)約資源，提高效率，并為此類藥物的臨床合理應(yīng)用及深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 揮發(fā)油類化學(xué)成分信息收集

選取2015 年版《中國(guó)藥典》一部中45 種含揮發(fā)油類成分的中藥，其中以揮發(fā)油為含量測(cè)定指標(biāo)的中藥材37 種[8]（八角茴香、薄荷、藏菖蒲、草豆蔻、草果、當(dāng)歸、豆蔻、莪術(shù)、楓香脂、甘松、干姜、紅豆蔻、花椒、姜黃、降香、荊芥、荊芥穗、沒藥、佩蘭、片姜黃、羌活、肉豆蔻、肉桂、乳香、砂仁、山柰、生姜、石菖蒲、檀香、細(xì)辛、香附、香薷、小茴香、辛夷、益智、油松節(jié)、紫蘇葉），已報(bào)道揮發(fā)油類成分有肝毒性的中藥7 種[15]（蒼術(shù)、柴胡、川楝子、吳茱萸、艾葉、山胡椒、小茴香），根據(jù)藥典中含量測(cè)定指標(biāo)成分或文獻(xiàn)報(bào)道含量較高的成分[16-34]，共篩選出揮發(fā)油類主要化學(xué)成分181 個(gè)，按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為9個(gè)大類，包括醛類15個(gè)、烯類39個(gè)、酮類27個(gè)、酯類17個(gè)、醇類31個(gè)、烷類15個(gè)、酚類18個(gè)、醚類11 個(gè)和酸類8 個(gè)。收集揮發(fā)油類主要化學(xué)成分相關(guān)信息，包括化學(xué)名稱、英文名稱、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)等，由Pubchem 下載化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)文件，未能下載的使用ChemDraw 畫出分子結(jié)構(gòu)式，用于預(yù)測(cè)分析。

1.2 預(yù)測(cè)軟件

ADMET Predictor，9.5 版，美國(guó) Simulation Plus 公司開發(fā)，是一款基于定量構(gòu)效關(guān)系模型（QSAR）的毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)軟件，可應(yīng)用于早期藥物開發(fā)毒性篩選[35]。該QSAR 模型是利用世界藥物索引中2000 多種藥物分子信息和專有的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)集成技術(shù)開發(fā)并經(jīng)過驗(yàn)證的預(yù)測(cè)軟件。詳細(xì)的模型描述、驗(yàn)證結(jié)果可參考官方網(wǎng)站和ADMET 預(yù)測(cè)軟件用戶手冊(cè)。選擇肝毒性、致突變性、心臟毒性和對(duì)CYP酶抑制活性預(yù)測(cè)模塊對(duì)化學(xué)成分的安全性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用pH 值7.4 的默認(rèn)設(shè)置，評(píng)價(jià)指標(biāo)采用軟件默認(rèn)的指標(biāo)，其中肝毒性采用ALT、AST 和LDH 同時(shí)升高標(biāo)記為具有肝毒性[36]；對(duì)CYP 酶預(yù)測(cè)選擇是否抑制CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4 等5 種酶的活性；心臟毒性選用hERG 的抑制指標(biāo)，遺傳毒性選擇致突變性指標(biāo)。同時(shí)參考文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)181個(gè)主要成分的安全性進(jìn)行綜合分析。

表1 揮發(fā)油類主要化學(xué)成分肝毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總

2 結(jié)果

2.1 肝毒性

2.1.1 肝毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

181個(gè)化學(xué)成分中，22個(gè)（12.1%）具有基礎(chǔ)毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中1 個(gè)化學(xué)成分（薄荷醇）明確無毒性，1 個(gè)化學(xué)成分（麝香草酚）有肝臟保護(hù)作用，20個(gè)化學(xué)成分具有肝毒性。文獻(xiàn)報(bào)道的肝毒性以大鼠的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為主，給藥周期均較長(zhǎng)，最短30 天，最長(zhǎng)達(dá)103 周，因此試驗(yàn)結(jié)果具有重要的參考意義，主要毒性反應(yīng)為引起動(dòng)物肝臟重量增加，其中5 個(gè)化學(xué)成分的肝毒性劑量小于100 mg·kg-1，包括甲基丁香酚、香荊芥酚、檸檬烯、草蒿腦、左旋香芹酮，其中甲基丁香酚毒性最強(qiáng)，劑量為30 mg/kg/d，相當(dāng)于人體等效劑量為300 mg/天，甲基丁香酚在細(xì)辛中的含量最高（1%），2015 版藥典中細(xì)辛的用量為1-3 g，按此劑量用藥，甲基丁香酚的攝入量可達(dá)30 mg/天，安全范圍可接受。對(duì)于含此類成分的藥材，需加強(qiáng)藥學(xué)研究，測(cè)定毒性成分的含量，確保用藥安全劑量，并在臨床應(yīng)用中觀察不良反應(yīng)。15個(gè)化合物的毒性劑量大于100 mg·kg-1，包括α-蒎烯[37]、薄荷酮[38]、庚醛、香葉烯、異薄荷酮、(E)-香葉醇、左旋乙酸冰片酯、正二十烷、芳樟醇、α-細(xì)辛醚、桉葉油素（桉樹腦）、(Z)-檸檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯和香葉醛，多種藥材中均含這些成分。此類成分雖有毒性，但安全范圍較寬，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意用藥周期及給藥劑量，以保障用藥安全。

2.1.2 預(yù)測(cè)研究肝毒性結(jié)果

QSAR 研究結(jié)果表明（表 2），有63 個(gè)化學(xué)成分具有肝毒性，占全部化學(xué)成分的34.8%。醛類化合物雖然較少，但80%成分（12 個(gè)）具有肝毒性，包括：3,4-二甲基-3-環(huán)己烯甲醛、左旋紫蘇醛、1-甲基-3-環(huán)己烯-1-吡咯甲醛、香茅醛、(E)-檸檬醛、2-癸烯醛、2,4-十二碳二烯醛、桂皮醛、2,4-癸二烯醛、4,4-二甲基-5-壬烯醛、(Z)-檸檬醛和香葉醛；其次烯類和酮類化合物發(fā)生肝毒性的比率相對(duì)較高，分別為59%和55%；酯類、醇類和烷類毒性發(fā)生率較低；酚類、醚類和酸類物質(zhì)基本無肝毒性。

表2 揮發(fā)油類主要化學(xué)成分肝毒性預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.3 肝毒性綜合分析

綜合分析表明，181個(gè)主要成分中，77個(gè)化學(xué)成分有肝毒性（42%），其中醛類發(fā)生率高達(dá)87%，烯類、酮類化合物發(fā)生肝毒性的比率超過60%。文獻(xiàn)報(bào)道有肝毒性，QSAR 預(yù)測(cè)也有肝毒性的化合物共6 個(gè)，分別是α-蒎烯、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯、左旋香芹酮、(Z)-檸檬醛、香葉醛。此結(jié)果表明，揮發(fā)油類成分長(zhǎng)期應(yīng)用具有肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，其中醛類成分的風(fēng)險(xiǎn)最高，其次是烯類和酮類，對(duì)含有此類成分的藥材應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量研究，可根據(jù)此類成分在藥材中的含量制定質(zhì)量控制指標(biāo)，確保臨床用藥安全。

2.2 致突變性

軟件主要是對(duì)Ames 試驗(yàn)（10 株沙門氏菌）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（表3），發(fā)現(xiàn)有6種成分提示有致突變性，包括，3-苯基-1-乙酰唑胺-二環(huán)[1.1.0]丁烷、乙酰丁香酮、木蘭脂素、2,3-二甲基-3-已醇、異歐前胡素和托酚酮，分別為柴胡、艾葉、吳茱萸、花椒、辛夷、阿魏、羌活和沒藥揮發(fā)油的主要化學(xué)成分。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，這6種成分結(jié)構(gòu)差異較大，無明顯共性結(jié)構(gòu)，提示此類物質(zhì)致突變性無明顯的規(guī)律可尋。有文獻(xiàn)報(bào)道[46]，甲基丁香酚體外Ames 試驗(yàn)證明無致突變作用，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有致癌性，認(rèn)為甲基丁香酚是一種人類致癌物。經(jīng)檢索危險(xiǎn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫（HSDB）等專業(yè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，有11 個(gè)成分已有實(shí)驗(yàn)表明無遺傳毒性，包括乙酸香葉酯、香茅醛、(Z)-檸檬醛、庚醛、香葉烯、草蒿腦、乙酸橙花酯、香葉醛、檸檬烯、芳樟醇、麝香草酚（百里酚）。

表3 揮發(fā)油類主要化學(xué)成分致突變性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖1 致突變性揮發(fā)油類化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式

結(jié)果表明，揮發(fā)油類成分遺傳毒性研究較少，僅有6%的化學(xué)成分有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，但因遺傳毒性是毒理學(xué)的重要指標(biāo)，因此后期應(yīng)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究，特別是預(yù)測(cè)結(jié)果為陽性的6 個(gè)成分，針對(duì)含此類成分含量較高的藥材進(jìn)行開發(fā)時(shí)應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量控制，并進(jìn)行相關(guān)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 心臟毒性

預(yù)測(cè)軟件以化學(xué)成分對(duì)hERG 編碼的鉀離子通道結(jié)合力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)hERG 鉀通道的抑制作用可引發(fā)致命性心律失常，因此含此類成分的藥物有心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，共有6 個(gè)化學(xué)成分顯示hERG陽性（表4），包括：木蘭脂素、榿木酮、去氫二異丁香酚、菜油甾醇、N,N'-二乙基二苯脲和3-羥基-6β-環(huán)丙烷-5β-膽甾烷，分別為辛夷、草豆蔻、肉豆蔻、蒼術(shù)和小茴香揮發(fā)油類的主要化學(xué)成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。

2.4 CYP450酶抑制

本研究中探討了化學(xué)成分對(duì)5 種CYP450 酶的抑制作用（表5），結(jié)果表明，揮發(fā)油類化學(xué)成分對(duì)CYP2C9 酶抑制作用最明顯，有58%的化學(xué)成分對(duì)其有抑制作用，除酸類化學(xué)成分外，各類成分均有抑制作用；36.5%的化學(xué)成分對(duì)CYP2C19 酶有抑制作用，其中醛類、烯類、酮類和醇類作用明顯；對(duì)CYP3A4 酶有抑制作用的化學(xué)成分較少，包括少量的酯類、烷類和酚類化學(xué)成分。酸類物質(zhì)抑制作用較為集中，只對(duì)CYP2C9酶有抑制作用。

表4 揮發(fā)油類主要化學(xué)成分心臟毒性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 心臟毒性揮發(fā)油類化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式

表5 不同類別化學(xué)成分對(duì)5種CYP酶的抑制作用

總體分析，中藥揮發(fā)油類成分對(duì)肝藥酶有一定的抑制作用，主要是對(duì)CYP2C9 酶和CYP2C19 酶有抑制作用的成分較多，但對(duì)活性最強(qiáng)的CYP3A4 酶有影響的成分較少。CYP2C9 酶和CYP2C19 酶分別參與了16%和2%臨床常用藥物的代謝[15]，主導(dǎo)部分心血管、抗精神病及抗凝血等藥物的體內(nèi)代謝，因此與這些藥物同時(shí)應(yīng)用時(shí)有可能增加臨床風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

在肝毒性研究中發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)研究結(jié)果與已有毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間存在差異，可能與觀察指標(biāo)不同有關(guān)。已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，揮發(fā)油類成分在動(dòng)物體內(nèi)大劑量、長(zhǎng)期內(nèi)用時(shí)可造成以肝臟重量升高為主的毒性反應(yīng)，而預(yù)測(cè)學(xué)研究以轉(zhuǎn)氨酶的變化為主要指標(biāo)。揮發(fā)油類部分成分雖有肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，推測(cè)毒性多在大劑量、長(zhǎng)期內(nèi)服時(shí)發(fā)生，大部分藥材在臨床上可安全使用，對(duì)于毒性成分含量較高的中藥材，在臨床應(yīng)用時(shí)重點(diǎn)關(guān)注藥物在臨床常用劑量下對(duì)轉(zhuǎn)氨酶的影響，同時(shí)為保證臨床用藥安全，可制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)毒性成分含量并控制使用劑量。

預(yù)測(cè)結(jié)果表明少量的化學(xué)成分具有致突變性，此類成分雖然數(shù)量較少，但其毒性風(fēng)險(xiǎn)較高，在多種藥材中均含有此類成分，如甲基丁香酚是細(xì)辛[47]和石菖蒲[48]揮發(fā)油的主要成分之一；木蘭脂素是辛夷[49]揮發(fā)油的主要成分之一，因此建議對(duì)含有此類成分藥中藥進(jìn)行新藥開發(fā)時(shí)應(yīng)開展詳細(xì)的臨床前遺傳毒性評(píng)價(jià)研究。

通過QSAR 預(yù)測(cè)研究，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分多方面安全性的定性分析，可為后期實(shí)驗(yàn)研究提供重要依據(jù)，不足之處是無法與用藥劑量相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)用藥安全性的快速判斷。本研究中結(jié)合已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、預(yù)測(cè)結(jié)果及藥典規(guī)定的用法用量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝毒性的預(yù)測(cè)分析，對(duì)于致突變性及心臟毒性還需積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，才能得出更加準(zhǔn)確的結(jié)論。

本研究采用QSAR 預(yù)測(cè)與文獻(xiàn)報(bào)道相結(jié)合的方法，對(duì)181 個(gè)揮發(fā)油類化學(xué)成分的肝功毒性、心臟毒性、遺傳毒性及對(duì)肝藥酶活性的影響等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究與分析，結(jié)果表明，揮發(fā)類成分安全性較好，以醛類成分為代表的少部分化學(xué)成分肝毒性發(fā)生率較高，主要的毒性表現(xiàn)是轉(zhuǎn)氨酶升高；極少量化成分可能具有心臟毒性或遺傳毒性；除部分化學(xué)成分對(duì)參與體內(nèi)其它藥物代謝相對(duì)較少的CYP2C9酶和CYP2C19酶有抑制作用外，僅少數(shù)化學(xué)成分對(duì)最重要的CYP3A4 酶有抑制作用。