擬南芥14-3-3蛋白GRF9調控番茄根系響應水分脅迫的生理機制①

章麗麗，李光杰，陸玉芳，施衛明*

擬南芥14-3-3蛋白GRF9調控番茄根系響應水分脅迫的生理機制①

章麗麗1,2，李光杰1，陸玉芳1，施衛明1*

(1 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049)

采用35S啟動子控制General Regulatory Factor 9 () 在兩個轉基因番茄株系(E2，E7)中高效表達，以野生型番茄WT、轉基因番茄E2和E7三個株系為試驗材料，在水培條件下用20% 聚乙二醇(PEG 6000)模擬干旱脅迫，探究了擬南芥14-3-3蛋白GRF9能否增強番茄根系響應水分脅迫的能力。結果表明：①在干旱脅迫下，野生型番茄和轉基因番茄的根系形態指標均受到不同程度的抑制，WT、E2和E7三個番茄材料相對總根長的受抑制程度分別為43%、28%、30%，相對根表面積的受抑制程度分別為46%、33%、35%，相對根體積的受抑制程度分別為47%、32%、29%，相對根直徑的受抑制程度分別為29%、21%、22%。②在響應干旱脅迫時，轉基因番茄根系蔗糖含量比野生型番茄高20%，根系干物質量比野生型番茄高23%。③在干旱脅迫時，轉基因番茄根系質膜H+-ATPase酶活性較高，具有較強的分泌質子的能力，其根系泌酸量比野生型番茄高35%。因此，GRF9能夠促進番茄根系蔗糖含量的增加和干物質的累積、增強根系分泌質子的能力，這對于轉基因番茄根系在總根長以及根表面積、根體積和根直徑的生長以響應干旱脅迫的過程中具有重要作用。

番茄；；根系形態；質子分泌；干旱脅迫

農業是對水分需求較大的產業，水資源短缺是限制農業生產的最重要因子之一。番茄()是世界上種植面積較大的主要設施蔬菜作物和重要的經濟作物，莖葉繁茂、蒸騰作用強、果實含水量達80% ~ 90%，其生長發育對水分的要求較高[1-3]。因此作物對水分脅迫的反應一直是研究的熱點。研究發現，植物在進化過程中，已經擁有一些完善的適應水分脅迫的生物學機制[4-5]。根系是植物感知和承受環境水分脅迫的主要部位，調控根系生長是植物適應水分脅迫的其中一個重要的生理機制[6-8]。長期水分虧缺，根系在大小和形態分布上會做出適應性調整，對水分虧缺適應性強的植物一般會有較發達的根系，增強利用地下深層的水分，滿足植株整體的需水要求[6-9]。

在擬南芥中已發現有15個14-3-3蛋白家族亞型，其中GRF9是擬南芥14-3-3蛋白家族中的一個成員[10-11]。GRF9能夠調控擬南芥根系生長，通過激活根系質膜H+-ATP酶活性以及調控地上部碳水化合物向根系運輸的方式促進擬南芥總根長和增強擬南芥根系對水分脅迫的適應能力[12-16]。但是，導入能否增強蔬菜作物番茄的根系對干旱脅迫的耐受性，尚不清楚。并且，如果轉基因的番茄根系對干旱脅迫的耐受性確實有所提高，是否根系形態參數的根表面積、根體積和根直徑均發生了相適應的改變，目前也不清楚。

因此，本次研究通過對比過表達番茄的兩個轉基因株系E2和E7以及野生型番茄WT三個番茄材料對20% 聚乙二醇(PEG 6000)模擬水分脅迫的根系響應過程，以探究的超量表達能否促進番茄根系總根長以及根表面積、根體積、根直徑的共同生長以提高對水分脅迫的適應性。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

中蔬四號番茄(L. cvZhongshu No. 4)(WT)，購自南京市金祥種業有限公司。構建受35S 啟動子控制的植物表達載體，通過農桿菌介導的方法[17]，將基因導入WT番茄，獲得轉基因番茄(E2、E7)。

選取飽滿的WT、E2和E7三個番茄材料的種子在自來水中浸泡15 min，用75% 酒精浸泡30 s，用純凈水沖洗；再用2%(/)的NaClO溶液劇烈振蕩滅菌15 ~ 20 min，用純凈水沖洗；置于(30±1) ℃培養箱黑暗萌發。

1.2 試驗設計

水培試驗：將發芽后的番茄種子轉移至帶有網眼的塑料托盤中，托盤置于裝有5 L 0.5 mmol/L CaCl2溶液的周轉箱中至番茄子葉展開，周轉箱內的溶液用1/5 Hoagland營養液替換。于人工氣候室內，待長出一片真葉后，將番茄苗轉移至含有1 L 1/2 Hoagland營養液的塑料罐中(每塊植物板上5個孔，每孔1株幼苗，共5株幼苗一個塑料罐)培養，溶液pH為6.0，每2 d更換一次營養液。待長出2 ~ 3片真葉(共培養18 d)，將每個品種分成兩組，加入含20% PEG6000的1/2 Hoagland營養液作為水分脅迫處理組(LW)，不含PEG6000的1/2 Hoagland營養液作為對照組(CK)，處理6 d。試驗重復3次。

植物生長的人工氣候室條件為相對濕度70%，光照、溫度晝夜循環：16 h光照、25 ℃，8 h 夜晚、22 ℃，光照強度200 ~ 250 μmol photons/( m·s)。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 DNA、RNA提取及PCR、Real-time PCR鑒定 植物DNA、RNA均提取自整株番茄幼苗，DNA采用CTAB法提取，參考王關林和方宏筠[18]的方法。PCR所用引物用Primer 5設計(F段序列為5′-AAGAGCGTGACACTTTCG-3′；R端序列為5′-CAGCAGCAGTAGTAGCAATC)，擴增產物大小為474 bp。RNA提取以及Real-time PCR反應參考Li等[19]的方法。表1中的引物均是用Primer 5 設計，選用番茄中表達較強的“house-keep”基因作為基因表達量的對照。

1.3.2 根系形態參數測定 用WinRHIZO根系分析儀(WinRHIZO，Regent，Canada)掃描分析總根長、根表面積、根體積和根直徑[21]。將正常水分培養(CK)下的各株系番茄根系的各項形態指標的絕對值定義為100%，則水分脅迫(LW)下各株系番茄根系的各形態指標變化的相對抑制率=(1–處理組各形態指標/對照組各形態指標)×100%。

1.3.3 植物干物質量測定 番茄植株地上部和根系分離后，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重。

1.3.4 蔗糖含量測定 稱取0.1 g植物干樣粉末，加入8 ml 80% 乙醇，80 ℃水浴30 min后取上清液0.9 ml，加入0.1 ml 2 mol/L NaOH沸水浴10 min，冷卻后加入1 ml 0.1% 間苯二酚和3 ml 10 mol/L HCl 80 ℃水浴1 h，冷卻后用紫外/可見光分光光度計進行比色測定[22]。

表1 本次試驗用的引物

1.3.5 根系泌酸量測定 處理6 d后的番茄幼苗培養6 h后的營養液回收，用0.1 mmol/L NaOH滴定，根據消耗的NaOH量計算質子分泌量[23]。

1.3.6 根系質膜H+-ATPase酶活性測定 質膜H+- ATPase酶的提取和質膜H+-ATPase酶活性參考Zhang等[24]和Shen等[25]的方法。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 和SPSS 20 軟件進行數據處理和統計分析，LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 轉基因AtGRF9番茄植株的確認及其轉錄水平的驗證

基因的cDNA通過農桿菌介導方法導入中蔬四號番茄獲得轉基因株系[17]，通過加代獲得T2代純合系的轉基因株系E2和E7。用PCR技術鑒定轉基因植物為導入的番茄，結果如圖1A所示，轉基因番茄植株的基因組中含有基因片段。此外Real-time PCR可以檢測是否在轉基因番茄中正常表達。本研究將培養18 d的番茄苗液氮冷凍、研磨、提取RNA后，用Primer 5設計的閱讀框的一對引物F: TGGGTTCTGG-AAAA-GAGCGTGACACT；R:CGAGAAGATCCTCCA-CGAAGCTCTCC 對試驗材料進行鑒定，如圖1B所示，擬南芥基因沒有在野生型番茄WT中表達，但同時在E2和E7兩個轉基因番茄品種中有高效表達量，說明能夠在番茄中表達。

2.2 水分脅迫對番茄根系形態的影響

如圖2所示，水分脅迫處理6 d后，番茄根系總根長、根表面積、根體積和根直徑的生長均受到了不同程度的抑制，但轉基因番茄兩個株系的抑制程度明顯低于野生型番茄，WT、E2和E7三個番茄材料總根長的相對抑制率分別為43%、28%、30%，根表面積的相對抑制率分別為46%、33%、35%，根體積的相對抑制率分別為47%、32%、29%；根直徑的相對抑制率分別為29%、21%、22%。可見，基因在維持轉基因番茄響應干旱脅迫下的根系大小和形態指標上具有重要作用。

(*表示同一處理不同株系番茄根系間差異達P<0.05顯著水平，n=9)

2.3 水分脅迫對番茄地上部和根系干物質量及蔗糖含量的影響

在模擬干旱脅迫條件下，各株系番茄地上部和根系的生長均受到了一定程度的抑制。從圖3A和圖3B中可以看出，野生型番茄受水分脅迫影響較為嚴重，地上部干物質量下降了34%，根系干物質量下降了27%；而轉基因番茄地上部干物質量僅下降19%，根系干物質量僅下降14%。

(柱圖上方不同小寫字母表示處理間差異達P<0.05顯著水平(n=9)，下同)

進一步比較WT、E2和E7番茄根系蔗糖含量以及根系和地上部蔗糖含量的比值(圖3C和3D)，轉基因番茄在水分脅迫下其根系蔗糖含量相比野生型顯著高出約20%，同時轉基因番茄根系和地上部蔗糖含量比值在水分脅迫下上升了10%，而野生型卻下降了7%，但3個株系地上部蔗糖含量無顯著差異。這些結果說明，GRF9能夠促進番茄根系蔗糖含量的增加、干物質的積累。

2.4 水分脅迫對番茄根系泌酸量和質膜H+-ATP酶活性的影響

圖4A和4B顯示，在模擬干旱脅迫下，轉基因番茄根系質子泌酸量和根系質膜H+-ATP酶活性受水分脅迫的抑制程度較小，分別抑制了18% 和20%，而野生型番茄受到較為嚴重的抑制，分別抑制了33% 和30%。轉基因番茄的泌酸量和質膜H+-ATP酶活性分別比野生型高33% 和27%。說明GRF9能夠促進番茄根系質子分泌，維持根系較好地生長以提高對水分脅迫的耐受性。

圖4 水分脅迫下各株系番茄根系的泌酸量和質膜H+-ATP酶的活性

3 討論

番茄是世界上種植面積較大的主要設施蔬菜和重要的經濟作物，也是我國主要的設施蔬菜之一，尤其在新疆等地加工番茄也形成區域化布局、產業化生產[26-27]。番茄生長發育對水分的要求較高[1-3]。然而，我國水資源匱乏，約一半的國土面積為干旱和半干旱地區[27-28]。由于水分短缺造成的干旱，嚴重影響了植物的生長發育，造成作物減產[29-30]，因此，提高以番茄為代表的作物的抗旱能力成為現代植物育種工作急需解決的關鍵問題。根系是植物重要的組成部分，是植物吸收養分和水分的重要器官，能夠最先感知植物生長的土壤環境變化[8,14,31-33]。研究認為，對干旱敏感的作物，其根系生長受抑制程度會比耐干旱品種明顯，抗旱品種具有較為發達的根系，因而在篩選作物耐旱品種時，常常把干旱脅迫下作物根總長、根表面積、根體積和根直徑這些根系形態指標的變化作為選種的參考依據[2,8,33-35]。雖然擬南芥過表達株系的總根長在10% PEG8000 模擬的干旱脅迫下，相比野生型擬南芥、擬南芥突變體而言，表現出較強的生長能力[12]；但目前并不清楚該基因是否可以在模式蔬菜番茄中起作用，同時也不清楚GRF9是否能夠使根系形態方面的根表面積、根體積和根直徑也發生適應性的變化以滿足植物對水分的需求。在本研究中，正常水分培養(CK)下，3個株系(WT、E2、E7)總根長的絕對值分別為528、497、504 cm，根表面積絕對值分別為36.2、33.7、34.1 cm2，根體積絕對值分別為0.213、0.188、0.183 cm3，根直徑絕對值分別為0.257、0.250、0.248 mm。圖2結果表明，20% PEG6000模擬的干旱脅迫處理6 d后，轉基因番茄的兩個株系(E2、E7)不僅總根長的生長能力大于野生型，而且根系的根表面積、根體積和根直徑的生長受抑制程度也明顯比野生型番茄小。說明GRF9減緩了干旱脅迫對番茄根系在總根長、根表面積、根體積和根直徑生長的抑制作用。相比野生型番茄，轉基因番茄根系的總根長、根表面積、根體積和根直徑在響應水分脅迫的生長中更有優勢。

植物為了促進根系生長，會適當減弱地上部的生長將光合作用產生的碳水化合物轉運到根系作為補償來適應干旱脅迫[14,36]。研究認為14-3-3蛋白通過與其他互作蛋白相互作用參與植物中很多的新陳代謝過程，調控植物生長發育，提高植物適應環境脅迫的能力[15,37]。利用轉反義技術減少14-3-3蛋白和在擬南芥中表達，致使擬南芥葉片中的淀粉累積增加，而蔗糖含量減少[38]。14-3-3蛋白對蔗糖磷酸合成酶的調控，使得植物偏向于將地上部光合作用產生的碳水化合物通過韌皮部向下運輸給根系，為根系在干旱脅迫下的生長提供能源物質，有助于植物根系擴大吸收面積，吸收更多的水分適應干旱脅迫的環境[12,32,36,39-40]。圖3A和3B中，野生型和轉基因番茄的地上部和根系干物質量均受到了水分脅迫的影響，但轉基因番茄的根系干物質量依然高于野生型番茄。通過進一步研究不同處理下各株系番茄地上部和根系蔗糖含量的變化，結果顯示(圖3C和3D)，GRF9增加了番茄根系蔗糖含量，使得根系蔗糖含量占比地上部蔗糖含量高于正常水分培養下的番茄。本研究推測，GRF9可能像在擬南芥中一樣，參與調控番茄地上部光合作用產物向根系運輸，為根系響應水分脅迫的生長提供能源物質[12,15]。

另外，植物細胞酸化生長學說認為細胞的伸長是由質子酸化引起細胞壁疏松而誘發的，而植物根系的生長需要依賴于根系細胞的伸長[41]。植物中的14-3-3蛋白通過與質膜H+-ATP酶自抑制區的結合建立一個高活性不穩定的ATPase:14-3-3蛋白復合體，以激活質膜H+-ATP酶的活性，質膜H+-ATP酶轉運質子促使根系能夠向細胞外分泌更多的質子，參與根系生長[42]。本試驗發現，GRF9能夠提高番茄根系質膜H+-ATP酶的活性，尤其是在水分脅迫下，其活性比同一處理下的野生型番茄高25%。因而，干旱脅迫下的轉基因番茄相比野生型番茄根系有較強的分泌質子的能力，轉基因番茄根系泌酸量高出野生型33%(圖4A和4B)，有利于轉基因番茄根系的伸長。

4 結論

擬南芥14-3-3蛋白GRF9如同在擬南芥中一樣，通過影響番茄根系的蔗糖含量以及調控根系質膜H+-ATP酶活性，使得轉基因番茄根系的生長能力顯著高于野生型。另外，GRF9也通過促進根系的總根長、根表面積、根體積和根直徑，提高番茄植物對干旱脅迫的適應能力。作為模式蔬菜的抗旱品種，該轉基因番茄在節水農業中的應用值得后續進一步探討。但干旱對植物形態和生理指標的影響很復雜，GRF9能否通過其他途徑提高番茄對干旱脅迫的抗性還需要進一步研究。

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Involvement of Arabidopsis GRF9 in Tomato Root Growth and Response Under Polyethylene Glycol Induced Water Stress

ZHANG Lili1,2, LI Guangjie1, LU Yufang1, SHI Weiming1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In order to improve water stress tolerance of tomato () plants, an expression vector containing an arabidopsis 14-3-3 protein,General Regulatory Factor 9 () cDNA driven by a cauliflower mosaic virus 35S promoter was transferred into tomato plants. Tomato wild-type (WT), two lines of GRF9-overexpressing tomato plants (E2, E7) were treated with 20% polyethylene glycol (PEG6000) to induce water stress under hydroponic culture conditions. Results showed: 1) The degree of water stress tolerance of transgenic tomato plants was found to be significantly greater than that of wild-type tomato plants as measured by root architecture development. The relative inhibition ratio-s of total root length of three lines tomato plants (WT, E2, E7) were 43%, 28% and 30%, respectively; the relative inhibition ratio of root surface area of three lines tomato plants (WT, E2, E7) were 46%, 33% and 35%, respectively; the relative inhibition ratio of root volume of three lines tomato plants (WT, E2, E7) were 47%, 32% and 29%, respectively; the relative inhibition ratio of root diameter of three lines tomato plants (WT, E2, E7) were 29%, 21% and 22%, respectively. 2) GRF9 favored the accumulation of sucrose in transgenic tomato (E2, E7) roots, and the root dry weight was 23% higher than that of WT. 3) In addition, GRF9 enhanced the activity of plasma membrane H+-ATPase in transgenic tomato (E2，E7) roots, and the root proton secretion was 35% higher than that of WT. Taken together, all the results indicated that under PEG-induced water stress, GRF9 is involved in enhancing proton secretion and accumulating more sucrose in the root to guarantee greater root architecture development on total root length, root surfaces area, root volume and root diameter. Therefore, Arabidopsis GRF9 plays an important role for tomato plants response to water stress.

;; Root architecture; Proton secretion; Water stress

Q945.12

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.01.011

章麗麗, 李光杰, 陸玉芳, 等. 擬南芥14-3-3蛋白GRF9調控番茄根系響應水分脅迫的生理機制. 土壤, 2020, 52(1): 74–80.

江蘇省青年基金項目(BK20151053) 和中國科學院南京土壤研究所知識創新工程領域前沿項目(ISSASIP1604)資助。

章麗麗(1989—)，女，浙江紹興人，博士研究生，主要從事植物營養生理生化與分子遺傳方面的研究。E-mail：llzhang@issas.ac.cn