EUROPattern全自動(dòng)免疫熒光核型和滴度判讀系統(tǒng)檢測(cè)抗核抗體的應(yīng)用評(píng)價(jià)

徐紅星， 劉藝， 朱琴芳， 徐衛(wèi)東

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院本部檢驗(yàn)科， 江蘇 蘇州 215002)

抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)是自身免疫性疾病最重要的診斷指標(biāo)之一[1]。抗核抗體靶抗原位于真核細(xì)胞細(xì)胞核中，但隨著人們對(duì)抗核抗體的深入研究，胞質(zhì)和細(xì)胞骨架中也相繼發(fā)現(xiàn)[2]。目前發(fā)現(xiàn)有臨床意義的抗核抗體很多，如抗dsDNA抗體、抗Scl-70抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體、抗Jo-1抗體等[3]。常用抗核抗體測(cè)定方法有間接免疫熒光法(indirect immuno-fluorescence method，IIF)、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法[4]等。其中間接免疫熒光法是抗核抗體檢測(cè)的參考方法[5-6]。

目前大部分實(shí)驗(yàn)室都用間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體，然后在熒光顯微鏡下用目視方法判讀，但是目視方法判讀煩瑣、效率低且人與人之間判定結(jié)果差異較大。隨著檢測(cè)標(biāo)本的不斷增加，目視方法判讀已不適用于臨床。為了滿(mǎn)足臨床的需求，能更快、更準(zhǔn)確地提供診斷依據(jù)，全自動(dòng)熒光判讀儀應(yīng)運(yùn)而生，使得熒光核型判讀自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。本研究評(píng)價(jià)EUROPattern全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)與目視方法判讀抗核抗體的結(jié)果是否有一致性和可比性，以期為臨床提供高效率、高精準(zhǔn)性的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2017年9月至2018年3月江蘇省蘇州市立醫(yī)院(本部)診斷為自身免疫性疾病且抗核抗體陽(yáng)性的患者177例，男34例，女143例，年齡20～70歲，平均51歲。健康對(duì)照組選自同期體檢者25例，男6例，女19例，年齡15～80歲，平均58歲。

1.2 主要試劑與儀器

歐蒙Sprint XL全自動(dòng)間接免疫熒光操作分析儀及抗核抗體IgG檢測(cè)試劑盒，EUROPattern Suit全自動(dòng)熒光判讀儀，OLYMPUS熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 間接免疫熒光法 應(yīng)用Sprinter XL全自動(dòng)間接免疫熒光儀進(jìn)行抗核抗體的檢測(cè)，試劑盒中生物載片上包被Hep-2細(xì)胞及猴肝細(xì)胞作為基質(zhì)抗原，檢測(cè)血清中抗核抗體。檢測(cè)時(shí)儀器自動(dòng)將血清標(biāo)本稀釋100倍，取25 μL加樣至基質(zhì)片上，室溫反應(yīng)30 min使血清中抗體與抗原結(jié)合，用緩沖液浸泡5 min洗去未結(jié)合抗體；加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人IgG抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合30 min，洗去未結(jié)合標(biāo)記抗體。甘油封片，自動(dòng)判讀、目視判讀抗核抗體核型和滴度。

1.3.2 全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng) EUROPattern Suit全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)由多個(gè)硬件和軟件模塊組合。使用時(shí)，打開(kāi)全自動(dòng)顯微鏡背部的開(kāi)關(guān)，雙擊“ELO”圖標(biāo)，輸入用戶(hù)名密碼登入軟件，根據(jù)日期新建一個(gè)任務(wù)，輸入或?qū)牖颊咝畔ⅲc(diǎn)擊“Create Protocol ”創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)流程，按順序放好基質(zhì)片，點(diǎn)擊“Start EPA microscope” 啟動(dòng)全自動(dòng)顯微鏡進(jìn)行自動(dòng)判讀，自動(dòng)判讀完成后審核結(jié)果，將結(jié)果輸出至LIS系統(tǒng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用χ2檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率及方法性能評(píng)價(jià)指標(biāo)間是否存在顯著性差異，用Kappa一致性檢驗(yàn)分析兩種方法抗核抗體結(jié)果符合率，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)抗核抗體陽(yáng)性率及方法學(xué)性能評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)，比較全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法判讀抗核抗體結(jié)果的陽(yáng)性率及靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法在自身免疫病組中的陽(yáng)性檢出率分別為97.2%和98.3%，健康組中陽(yáng)性檢出率分別為4.0%和0，總體的陽(yáng)性檢出率分別為85.6%和86.1%，兩種判讀方法的陽(yáng)性檢出率均無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表1；兩種方法判讀抗核抗體結(jié)果的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，其差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法抗核抗體陽(yáng)性率比較

表2 全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法性能評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

2.2 兩種抗核抗體熒光判讀方法一致性分析

全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法在177例自身免疫病患者中熒光核型同時(shí)陽(yáng)性有169例，而25例健康對(duì)照組中同時(shí)陰性有24例，其符合率分別為95.4%和96.0%，總體符合率為95.5%，兩種方法一致性檢驗(yàn)結(jié)果Kappa值為0.816(介于0.075～1.000)，見(jiàn)表3。

表3 全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法抗核抗體結(jié)果符合率比較

2.3 兩種方法判讀抗核抗體所得熒光核型分布比較

以目視判讀抗核抗體熒光核型結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，將全自動(dòng)判讀系統(tǒng)的核型判讀結(jié)果與之相比較，兩種方法總體一致率為85.1%。不同熒光模式其一致率由高到低分別為核點(diǎn)型(100%)、著絲點(diǎn)型(93.8%)、均質(zhì)型(91.7%)、核仁型(88.5%)、胞質(zhì)型(84.6%)、顆粒型和混合型(均80.0%)。見(jiàn)表4。

表4 兩種判讀方法檢測(cè)核型分布比較

2.4 兩種方法滴度判讀符合率分析

對(duì)于兩種方法核型判讀相同的標(biāo)本，進(jìn)一步分析其滴度判讀的符合率，結(jié)果顯示除混合型外，其余均有較高的符合率，不同熒光模式其符合率由高到低分別為核點(diǎn)型、核仁型、著絲點(diǎn)型、顆粒型、均質(zhì)型、胞質(zhì)型和混合型。見(jiàn)表5。

表5 兩種方法中相同熒光核型的滴度判讀符合率

3 討論

自身免疫性疾病因自身免疫功能紊亂而產(chǎn)生針對(duì)正常組織器官的病理性抗體[7]，其中抗核抗體在其診斷以及預(yù)后中有重要意義，且研究發(fā)現(xiàn)抗核抗體陽(yáng)性可早于臨床癥狀或部分特異性抗體5年[8]。但因抗核抗體檢測(cè)方法多樣，操作人員工作條件、技術(shù)水平、結(jié)果判讀缺乏標(biāo)準(zhǔn)等各種原因，抗核抗體檢測(cè)尚不規(guī)范[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EUROPattern全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)顯示了高度準(zhǔn)確的抗核抗體判讀結(jié)果。兩種方法在所有研究對(duì)象中陽(yáng)性率分別為85.6%和86.1%，在自身免疫病患者中的陽(yáng)性率達(dá)97.2%和98.3%。全自動(dòng)判讀系統(tǒng)和目視判讀方法判讀抗核抗體結(jié)果的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度均很高(均≥96%)，且都有較好的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，兩種方法間均無(wú)顯著性差異。

進(jìn)一步比較兩種方法對(duì)抗核抗體熒光核型陰性和陽(yáng)性結(jié)果的符合率，可見(jiàn)兩種檢測(cè)方法的總體符合率為95.5%，在自身免疫病患者及健康對(duì)照者中符合率分別是95.4%和96.0%，兩種方法一致性檢驗(yàn)結(jié)果Kappa值為0.816。因此，全自動(dòng)判讀系統(tǒng)陰性和陽(yáng)性判讀結(jié)果可信度較高。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道，全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)和傳統(tǒng)目視判讀方法在陰性和陽(yáng)性結(jié)果的一致性可達(dá)99.4%[10-11]。

間接免疫熒光法測(cè)定抗核抗體的常見(jiàn)熒光模式分為3類(lèi)，細(xì)胞核型：包括顆粒型、均質(zhì)型、核仁型、著絲點(diǎn)型等；胞質(zhì)型：包括胞質(zhì)顆粒、線(xiàn)粒體、溶酶體等；有絲分裂型：紡錐體、中心體等[12]。本實(shí)驗(yàn)中全自動(dòng)判讀系統(tǒng)與目視判讀方法的核型判讀具較高一致率，其總體一致率為85.1%，不同熒光模式的一致率由高到低分別為核點(diǎn)型、著絲點(diǎn)型、核均質(zhì)型、核仁型、胞質(zhì)型、核顆粒型和混合型。本實(shí)驗(yàn)中，核點(diǎn)型因例數(shù)較少而得到100%的一致率。顆粒型和混合型的一致率最低，均為80.0%。分析發(fā)現(xiàn)，50例目視判讀顆粒型的標(biāo)本，全自動(dòng)判讀系統(tǒng)判讀結(jié)果中顆粒型40例，混合型7例，分析其原因，可能是目視判讀方法因多種熒光模式重疊或非特異熒光的存在而導(dǎo)致混合型判讀為顆粒型[13]。

對(duì)于全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)和目視判讀方法核型判讀結(jié)果相同的標(biāo)本，進(jìn)一步分析其滴度判讀的符合率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除混合型外，其余核型均有較高的符合率，不同熒光模式其符合率由高到低分別為核點(diǎn)型、核仁型、著絲點(diǎn)型、顆粒型、均質(zhì)型、胞質(zhì)型和混合型。混合型本身因核型復(fù)雜而致判讀困難，故符合率較低(66.7%)。混合型滴度不一致原因主要是目視判讀滴度低于儀器判讀滴度，部分標(biāo)本目視判讀陰性而儀器判讀為低滴度，以及核型判讀不一致。因此，就判讀滴度而言，儀器判讀優(yōu)于目視判讀。另外還可通過(guò)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋?zhuān)篃晒庹诒巫兊每梢?jiàn)，從而使混合型得到準(zhǔn)確的識(shí)別。

總體而言，全自動(dòng)熒光判讀系統(tǒng)對(duì)抗核抗體核型和滴度判讀的結(jié)果與傳統(tǒng)目視判讀結(jié)果比較，顯示出較高的靈敏度、特異性及符合率。且能有效減少因主觀因素而致抗核抗體檢測(cè)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、實(shí)驗(yàn)室間的不一致性，提高實(shí)驗(yàn)室間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體的工作效率，從而實(shí)現(xiàn)間接免疫熒光檢測(cè)抗核抗體的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，更好地滿(mǎn)足臨床需求。