淅川烏骨雞全基因組轉座子的鑒定與分析

李東華，付亞偉，張晨曦，曹艷芳，李文婷，李轉見，康相濤，孫桂榮

淅川烏骨雞全基因組轉座子的鑒定與分析

李東華，付亞偉，張晨曦，曹艷芳，李文婷，李轉見，康相濤，孫桂榮

（河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450046）

【】通過分析淅川烏骨雞全基因組重測序數據，獲取淅川烏骨雞轉座子的基本信息和特征分布，探究轉座子相關基因參與的通路。不僅對研究淅川烏骨雞轉座子的生物學功能具有重要的意義，而且為探索基因組擴增、基因組功能及進化研究提供重要基礎數據。對淅川烏骨雞血液DNA進行全基因組重測序，采用雙末端短序列比對基因組，運用RepeatModeler、TEclass、RepeatMasker等使用流程對轉座子進行鑒定、構建、校正、分類和注釋，獲得淅川烏骨雞整個基因組所有的轉座子，對轉座子的特征、分布及和基因的關系等方面進行分析。并對轉座子插入的所有基因進行GO和KEGG數據庫富集，分別結合GO和KEGG注釋結果對功能進行描述。經鑒定、分類和注釋，淅川烏骨雞共鑒定到370 252個轉座子序列，分為19個超家族，主要為CR1、TcMar-Mariner、ERVL、ERV1等超家族，進一步說明淅川烏骨雞轉座子類型主要是逆轉錄轉座子；轉座子的數目和染色體長度有關，染色體越長，轉座子數目越多。在基因組中轉座子和基因的密度成反比，基因密集的區域中轉座子密度較低；基因組內轉座子的插入并非隨機的，LTR/ERVL、LTR/ERV1、DNA/PIF-Harbinger、DNA/Hat-Charlie、RC/Helitron等轉座子傾向于插入基因外部。GO富集分析表明，在生物過程條目中鑒定出的轉座子富集相對較多的是細胞過程、單生物過程、代謝過程、生物調節、刺激反應等；分子功能條目中鑒定出的轉座子富集相對較多的是結合、催化活性等；細胞組分條目中鑒定出的轉座子富集相對較多的是細胞部分、細胞器、膜等。KEGG富集分析表明，鑒定出的轉座子主要在甘油酯代謝、PPAR信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗、Jak-STAT信號通路等通路。著重關注了與淅川烏骨雞特性相關的通路，如和色素沉積有關的酪氨酸代謝、和肉品質有關的脂代謝、脂肪酸的合成、PI3K-Akt信號通路等。轉座子含量與基因組大小，具有一定的正相關性，而且淅川烏骨雞轉座子在基因組的分布存在一定偏好性。轉座子相關基因在色素相關通路中富集，其可能與淅川烏骨雞的種質特性有關，具體的調控機制還有待進一步研究。

雞；全基因組重測序；轉座子；特征分析

0 引言

【研究意義】轉座子（簡稱TEs），又稱易位子，跳躍基因，指存在于基因組上可以自主復制和位移的一段DNA片段[1]，構成了高等生物基因組的大部分并且其在不同生物基因組中的含量有非常大的變化。利用全基因組重測序篩選淅川烏骨雞有關的轉座子，從而發現與淅川烏骨雞種質特性有關的轉座子。【前人研究進展】轉座子主要分為Class I 型轉座子和Class Ⅱ型轉座子兩大類[2]。Class I 型轉座子，又稱逆轉錄轉座子。以RNA為介導進行轉座，屬于“DNA-RNA- DNA”型，每轉座一次相應拷貝數增加，基因組增大；且本身帶有調控元件，所以會對宿主基因的表達造成影響。主要包括長末端重復元件（LTRs），內源性反轉錄病毒（ERV），長散布元件（LINEs）和短散布元件（SINEs），后兩者又被統稱為非長末端重復元件（Non-LTRs）。Class Ⅱ型轉座子，也稱作DNA轉座子。以DNA為介導進行轉座，屬“DNA-DNA”型，造成基因的突變或者重排，一般對基因組大小沒有影響。此類轉座子包括微型反向重復轉座元件（MITEs）和滾筒式轉座子（helitron）[3]。轉座子在20世紀50年代被McClintock在玉米中首次發現[4]，在很長一段時間，一直被當做是基因組中的一類無用的“垃圾序列”[5]。然而，近年來，隨著越來越多物種全基因組測序的應用，關于染色體結構[6]、基因組大小[7]、基因組重排[8]、新基因生成[9]和基因表達調控[10]等受轉座子影響的研究報道越來越多，在分子生物學研究中被廣泛應用于基因治療、轉基因動物制備和物種進化等研究[11-13]。目前，轉座子插入對畜禽的影響也已被廣泛報道，Clark等[14]研究發現在狗silver基因SINE插入進而影響毛色表型。DALL'OLIO等[15]研究表明在賽馬MSTN基因轉座子的插入，影響馬的賽跑距離。豬VRTN基因轉座子的插入影響豬脊椎數發育[16]。【本研究切入點】淅川烏骨雞是2011年列入的《中國畜禽遺傳資源志-家禽志》中的一個新的遺傳資源。具有“烏嘴、烏腿、烏皮、烏骨、烏肉、綠殼蛋”等特征；遺傳性能穩定、覓食力強、適應性廣、喜群居、耐寒性強、飼料消耗少、具有藥用保健功能等優點。近年來，隨著測序技術的發展，越來越多的生物基因組序列被測定，為從基因組水平進行轉座子的鑒定、分類、注釋等提供了便利，轉座子幾乎存在于所有生物體基因組中，并在真核生物基因組中占據重要組成部分，尤其是脊椎動物[17-19]。然而關于雞轉座子方面的研究還鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究利用淅川烏骨雞全基因組重測序數據，從全基因組范圍內進行轉座子鑒定、分類和特征分析，為淅川烏骨雞基因組功能和進化研究等提供重要基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30周齡的淅川烏骨雞母雞5個個體來源于河南省淅川縣，翅下靜脈采血，采集約1 mL的血液置于3 mL抗凝管（EDTA）中，上下顛倒使抗凝劑和血液混勻后放入-20冰箱保存，備用。

1.2 血液DNA提取

采用氯仿-苯酚法提取雞血液DNA，使用NanoDrop進行濃度檢測。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和完整性（電壓150V，電泳30 min）。

1.3 DNA文庫構建和全基因組重測序

使用超聲波將淅川烏骨雞血液DNA序列片段化，然后進行純化、末端修復、3′端加A、加接頭后，磁珠吸附進行富集400 bp左右的隨機片段，PCR擴增形成測序文庫。文庫質檢合格后使用Illumina HiSeq 4000 進行雙末端測序（每個個體30X）。

1.4 全基因組轉座子的鑒定和注釋

根據RepeatModeler（http://www.repeatmasker.org/ RepeatModeler/），TEclass（http://www.compgen.uni-muenster.de/teclas），RepeatMasker（http://www. repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker）使用流程對產生的重復序列的一致性序列進行鑒定、構建、校正、分類和注釋。

1.5 轉座子家族區分

根據80-80-80規則對轉座子進行家族劃分[20]。兩個元件的序列中的最短序列（＞80 bp）滿足編碼區、兩端的重復區域、或者全長的80%的序列有80%的相似度中的其中任意一個條件。

1.6 轉座子與基因的關系

基于大于scaffold N50以上的所有scaffold對轉座子的特征進行分析。對4 Mb窗口上轉座子和基因的分布進行分析；且對轉座子在基因內部、基因外部（上下2 kb）區域插入偏好性進行統計分析。

1.7 轉座子相關基因GO功能注釋及KEGG Pathway分析

為了進一步了解轉座子的功能，我們對在基因上下2 kb區域以及基因內部有轉座子插入的基因使用Blast 2 GO[21]進行Gene Ontology（GO）和KEGG Pathway功能注釋。

2 結果

2.1 基因組中TEs的鑒定

經過過濾分析，我們在淅川烏骨雞基因組當中鑒定到有370 252個轉座子序列，基于80-80-80規則，分為19個超家族（表1），主要是CR1、TcMar-Mariner、ERVL、ERV1等超家族，進一步說明淅川烏骨雞的轉座子類型主要是逆轉錄轉座子。

表1 基因組轉座子統計分析

2.2 淅川烏骨雞轉座子的全基因組注釋

通過對淅川烏骨雞全基因組注釋分析，比對（Masked）的轉座子序列總計占到了淅川烏骨雞基因組已有測序序列的18.29%（表2）。逆轉錄轉座子占總Masked序列的96.88%，其中LINE轉座子所占比例最高，占逆轉錄轉座子總Masked序列的6.43%。除此之外，L3/CR1也占到總Masked序列的6.38%。DNA轉座子只占到總Masked序列的1.33%，其中以DNA所占Masked序列比最高（1.21%）。

2.3 轉座子與基因關系的分析

轉座子和基因的關系分析結果見表3和圖1所示，1、2、3、4、Z號染色體分布的轉座子較多（表3），說明轉座子的多少和染色體的長度有關，染色體越長，轉座子數目越多；而且轉座子比例高，基因的比例則低，反之亦然（圖1）。說明轉座子和基因的分布呈現強烈的負相關性。個別轉座子在個別區間分布較高的現象說明了轉座子在基因組上的分布區間是有一定的偏好性。

表2 淅川烏骨雞全基因組轉座子注釋信息

表3 轉座子在染色體上的分布

A：1號染色體；B：2號染色體；C:4號染色體；D：Z染色體。綠色線：轉座子數量；藍色線：基因數量

2.4 轉座子插入基因組位置偏好性

因為轉座子的覆蓋度和基因密度有負相關關系，我們以超家族分類的轉座子為對象，進而分析轉座子插入在基因組上的位置與基因在基因組上的位置之間的關聯性。通過對轉座子插入基因上下游和基因內部的偏好性進行分析發現，LTR/ERVL、LTR/ERV1等轉座子傾向于插入基因外部（圖2-A）；DNA轉座子分析發現，DNA/TcMar-Mariner、DNA/PIF-Harbinger、DNA/Hat- Charlie、RC/Helitron等轉座子在基因外部和基因內部都有相對較高的插入，但是更傾向于插入基因外部（圖2-B）

2.5 轉座子相關基因GO功能注釋及分析

為了解這些轉座子相關基因功能，我們對10 845個基因進行GO功能注釋。有7 231個基因注釋在64個GO條目。對富集轉座子數量較多的前24個GO條目以柱狀圖方式展示見圖3，由圖可知，生物過程條目中富集的轉座子相關基因最多（51.8%），富集相對較多條目的是單生物過程，代謝過程，生物調節，生物過程的調控，刺激反應等；在細胞組分條目下富集的轉座子相關基因占33%，富集相對較多的是細胞部分，細胞器，膜等；在分子功能中富集的轉座子相關基因占15.2%，富集相對較多的是結合，催化活性等。

2.6 轉座子相關基因功能Pathway分析

進一步對10 845個與轉座子相關基因進行KEGG富集分析，共有2 535個相關基因注釋在338個KEGG通路中。富集較多的前20個通路見表4，由表可知，主要集中在甘油酯代謝，PPAR信號通路，PI3K-Akt信號通路，胰島素抵抗，Jak-STAT信號通路等通路。其中著重關注了和淅川烏骨雞特性相關的通路，如和色素沉積相關的酪氨酸代謝、和肉品質相關的脂代謝、脂肪酸的合成、PI3K-Akt信號通路等（圖4），這些通路下的轉座子具生物學功能還需進一步研究。

3 討論

對淅川烏骨雞全基因組水平轉座子的特征及轉座子相關基因生物信息學分析等方面進行了研究。結果表明，在淅川烏骨雞基因組中有大量的轉座子存在，且在基因組上的分布不是隨機的，具有區域偏好性的，與前人研究一致[22-23]。有些轉座子傾向于插入在基因內部，有些轉座子在基因外部。本研究使得我們對淅川烏骨雞中轉座子的特性有了更進一步的了解。

圖2 轉座子插入基因組分布偏好性

圖3 轉座子相關基因的GO富集分析

3.1 轉座子所占基因組比例

近年來，大規模基因組測序技術為轉座子的研究提供了新的契機，通過生物信息學分析發現，在很多的物種中都有轉座子的存在，所占基因組的比例等出現不同的分布趨勢，如占擬南芥基因組的14%[24]，玉米基因組的84.2%[25]，桑樹基因組的37.87%[26]，人類基因組的44%[27]，小鼠基因組的40%[28]，斑馬魚基因組的54.96%[29]，占淅川烏骨雞基因組的18.29%；雖然各個物種的轉座子含量不同，然而其轉座子含量與基因組大小密不可分，具有一定的正相關關系。通常認為基因組大小與DNA含量增加和刪減丟失共同作用有關，其中轉座子拷貝的增多是導致基因組增大的一個重要因素[30-31]。

表4 轉座子相關基因富集較多的20個代謝通路

圖4 轉座子相關基因的Pathway富集分析

3.2 轉座子和基因的關系

雖然轉座子占淅川烏骨雞基因組的18.29%，但是這些轉座子在基因組上的分布卻并非是隨機的，呈現相反趨勢，基因分布集中的位置，轉座子的分布會減少，在擬南芥和人等其他一些測序物種的轉座子的比較中也是相同的發現[32-34]，這種現象可能是基因組自身的一種保護方法，避免轉座子的插入導致功能基因的失活。通過對轉座子和基因之間的相對位置進行分析，以確定是否某些轉座子在基因組上存在一定的偏好性，進而影響某個基因的功能。研究發現，一些超家族的轉座子在基因組上位置分布確實存在一定偏好性。可能和淅川烏骨雞的進化歷程有密切關系，某些轉座子的激活受不同的環境、遺傳等因素的影響，大量擴增，從而導致進一步富集到基因組的某些區域。

3.3 Pathway富集分析

通過進一步對轉座子相關基因功能注釋，這些轉座子相關基因參與了多個生物學過程，物種的表型、生產性能等受轉座子的調節。已有研究表明，通過分子重構分別獲得的Sleeping Beauty、Frog Prince和Hsmar1復活的活性Tc1/Mariner轉座子，在魚類、青蛙、鼠等動物中被廣泛研究[35-39]；Takeuchi等[40]和Asakawa等[41]利用Tol2轉座子介導Gal4-UAS系統，影響斑馬魚神經元和行為相關基因功能。LINE-1轉座子通過影響基因的表達或調控，進而導致基因疾病[42-43]。在家禽中，轉座子的插入導致了慢羽表型的突變[44-45]，或者不僅能夠降低白來航雞8%—9%的產蛋率，還能降低蛋重和蛋比重[46]。基因的5′非編碼區有轉座子的反向插入，從而啟動了SLCO1B3基因在卵殼腺中的特異性表達，形成綠殼蛋[47]。在研究中，SLCO1B3基因也存在轉座子的插入。轉座子相關基因在酪氨酸代謝通路中富集，其可能與淅川烏骨雞“烏嘴、烏腿、烏皮、烏骨、烏肉”等典型的種質特性有關，具體的調控機制還有待進一步研究。

4 結論

通過對淅川烏骨雞全基因組重測序數據的轉座子分析，基于80-80-80規則，轉座子分為19個超家族，在各條染色體的位置分布研究發現，它們在染色體上的分布不均勻，與基因的密度成反比，在基因密集的區域中轉座子密度較低，轉座子在基因組內的插入非隨機的。GO富集分析表明，轉座子相關基因主要在細胞過程、單生物過程、結合、催化活細胞部分、細胞器、膜等條目下富集較多。KEGG富集分析表明，鑒定出的轉座子相關基因主要在甘油酯代謝、PPAR信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗、Jak-STAT信號通路等通路。

隨著高通量測序技術的不斷提高，使得更好的分析轉座子成為可能，進而為揭示轉座子的轉座機制提供重要的依據，同時也將為研究基因功能，探索物種內部的進化提供一種全新的思路。

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Genome-Wide Identification and Characterization of Transposable Elements in Xichuan Black-Bone Chicken

LI DongHua, FU YaWei, ZHANG ChenXi, CAO YanFang, LI WenTing, LI ZhuanJian, KANG XiangTao, SUN GuiRong

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046）

【】The aim of the study was to analyze the whole genome re-sequencing data of Xichuan black-bone chicken to obtain the identification, classification, distribution of the transposon of Xichuan black-bone chicken, and to explore the pathways involved in transposon-related genes, which not only had important significance for studying the biological function of the Xichuan black-bone chicken transposon elements (TEs), but also provided important basic data for exploring genome amplification, genome function and evolution research. 【】In this study, whole genome resequencing of blood DNA of Xichuan black-bone chicken was performed, and the paired-end mapping methods alignment genome was used. The TEs was identified, constructed, corrected and classified by RepeaterModeler, TEclass, RepeatMasker and other processes. All TEs in the whole genome of Xichuan black-bone chicken were obtained to analyze the characteristics, distribution and relationship of their genes. All genes inserted in the TEs were subjected to GO and KEGG databases enrichment, and the functions were described in combination with GO and KEGG annotation results, respectively. 【】 After identification, classification and annotation, 370 252 TEs sequences were identified in Xichuan black-bone chicken, which were divided into 19 superfamilies, mainly CR1, TcMar-Mariner, ERVL, ERV1 and other superfamilies, further indicated that the TEs types of Xichuan black-bone chicken were major TEs. The number of TEs was related to chromosome length, and longer the chromosome was, the more the number of TEs was. Number of TEs was inversely proportional to the density of gene. TEs density was relatively low in gene dense regions. The insertion of TEs in genome was not random, LTR/ERVL, LTR/ERV1, DNA/PIF-Harbinger, DNA/Hat-Charlie, RC/Helitron tend to be inserted outside the gene. GO enrichment analysis indicated some of these genes related to TEs were enriched in the following biological process terms: cell process, single-organism process, metabolic process, biological regulation, response to stimulus. In addition, some of these genes related to TEs were enriched in the following molecular function terms: binding and catalytic activity. Furthermore, some of these genes related to TEs were enriched in the following cell component terms: cell parts, organelles, and membranes. KEGG enrichment analysis indicated that these genes related to TEs mainly focused on Glycerolipid metabolism, PPAR signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, Insulin resistance, and Jak-STAT signaling pathway. This study mainly focused on the pathways related to the characteristics of Xichuan black-bone chicken, such as tyrosine metabolism related to pigmentation, lipid metabolism related to meat quality, fatty acid synthesis, and PI3K-Akt signaling pathway. 【】There was a positive correlation between TEs content and genome size of Xichuan black-bone chicken. Moreover, the TEs of Xichuan black-bone chicken had a certain preference in the distribution of genome. TEs related genes were enriched in the pigmentation related pathway, which might be related to the germplasm characteristics of Xichuan black-bone chicken. The specific regulatory mechanisms remained to be further studied.

chicken; whole genome resequencing; transposon elements; characterization analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.017

2019-01-22；

2020-01-13

國家現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-40-K04）、教育部創新團隊（IRT16R23）、河南省科技重大專項（151100110800）

李東華，Tel：15516976656；E-mail：lidonghua6656@126.com。通信作者康相濤，E-mail：xtkang2001@263.net。通信作者孫桂榮，E-mail：grsun2000@126.com

（責任編輯 林鑒非）