高溫脅迫對葡萄幼樹生理指標和超顯微結構的影響

劉敏，房玉林

高溫脅迫對葡萄幼樹生理指標和超顯微結構的影響

劉敏1,2，房玉林1,3

（1西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801；3陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100）

【】研究高溫脅迫對葡萄生理指標和超顯微結構的影響，探討葡萄在高溫脅迫下的生理響應機制。以一年生歐亞種‘赤霞珠’和刺葡萄‘君子1號’扦插苗為試驗材料，在35℃、40℃和45℃植物培養箱中連續處理48 h，以25℃培養的植株作為對照，檢測葡萄葉片的相對電導率、相對含水量、葉綠素總量、抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）/超氧陰離子/過氧化氫含量、葉綠素熒光參數和光合參數，并通過掃描電鏡和透射電鏡對氣孔形態和葉綠體結構進行觀察。在35℃和40℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’的植株形態、相對電導率、相對含水量、葉綠素總量、葉綠素熒光參數均無顯著變化，但凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導度（Gs）顯著降低；在45℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’號均出現脅迫癥狀，相對電導率顯著增加，相對含水量、葉綠素總量、Fv/Fm、ΦPSII、Pn、Tr和Gs顯著降低，且‘君子1號’各參數的變化幅度大于‘赤霞珠’。隨著處理溫度的升高，葡萄葉片中丙二醛/超氧陰離子/過氧化氫含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性不斷增加，而過氧化氫酶（CAT）在中度高溫脅迫下活性最高，且‘赤霞珠’SOD和CAT活性的增加幅度大于‘君子1號’。掃描電鏡觀察發現，常溫下‘赤霞珠’的氣孔密度大于‘君子1號’，在高溫處理后葡萄葉片的氣孔開張度減小，但氣孔大小無顯著變化。用透射電鏡觀察發現，高溫處理使葉綠體的體積變大、形狀變圓，葉綠體膜解體，出現大量巨型淀粉粒，并在‘君子1號’葉綠體上觀察到大量嗜鋨顆粒?！嘞贾椤臍饪酌芏却?，葉綠體結構穩定，高溫處理后SOD和CAT活性大幅增加是其耐熱性高的重要原因。

赤霞珠；刺葡萄；高溫脅迫；光合作用；抗氧化酶；葉綠體

0 引言

【研究意義】隨著全球氣候變暖和夏季極端高溫天氣頻發，高溫脅迫已經成為制約農業生產的主要逆境之一。葡萄是世界上廣泛種植且具有較高經濟價值的果樹，在高溫脅迫下葡萄植株生長受到抑制，葉片發生卷曲干枯，果實發生日灼現象，嚴重影響果實的品質和產量[1]。因此，研究葡萄高溫響應機制對于提高葡萄植株耐熱性，保證夏季植株生長和果實發育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在高溫脅迫下，植物體內會產生大量對細胞有害的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），比如超氧陰離子（）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，從而引起氧化脅迫[2]。ROS的增加對細胞結構和功能造成很大傷害，可以使葉綠體和線粒體發生膨脹，蛋白和核酸等大分子變性，還能引起DNA斷裂[3]。植物在長期的進化過程中形成了完善而復雜的抗氧化系統來清除ROS，以降低其對細胞的傷害。常見的抗氧化酶包括過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等。高溫脅迫對葡萄葉片中抗氧化酶活性的影響不盡相同。張俊環等[4]對‘京秀’葡萄幼苗進行45℃高溫處理，發現葉片中CAT、POD和SOD 3種酶的活性有不同程度的降低，其中SOD活性的降低幅度最大。查倩等[5]對‘夏黑’葡萄幼苗進行45℃高溫處理，在處理6 h后SOD活性顯著降低，在處理150 h后恢復至正常水平；而POD和CAT活性在處理6 h和150 h后均顯著高于對照。一般認為，適度的高溫脅迫會增加葡萄葉片中抗氧化酶的活性，當溫度超過一定范圍時，抗氧化酶的蛋白結構受到破壞，活性顯著降低。高溫對植物體中抗氧化酶活性的影響因品種、器官、發育階段、處理時間、處理溫度、抗氧化酶種類的不同而有所差異[6]。光合作用是植物物質轉化和能量代謝的關鍵，其對于高溫非常敏感，這是由于光系統II（PS II）的活性容易受到高溫的抑制[7-9]。高溫脅迫會導致植物吸收的光能超過CO2同化所需的量，引起植物體內ROS的積累，造成PSII的損傷[10-13]。有研究表明，葡萄在受到高溫脅迫后，供體側放氧復合體比受體側的電子傳遞對高溫更加敏感[14-15]?！颈狙芯壳腥朦c】刺葡萄是我國特有的野生葡萄種質資源，離體葉片的高溫處理結果顯示，刺葡萄的耐熱性顯著高于其他野生品種和栽培品種[16]，但是刺葡萄盆栽苗在控制條件下的高溫響應機制尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】本研究以歐亞種‘赤霞珠’和刺葡萄‘君子1號’扦插苗為試驗材料，進行不同溫度的高溫處理，通過抗氧化酶、光合參數等指標的測定和掃描電鏡、透射電鏡的觀察，比較兩個葡萄品種的耐熱性，研究葡萄在高溫脅迫下的生理響應機制，為耐熱品種的選育和耐熱機理的研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2018年3—6月在西北農林科技大學葡萄酒學院溫室進行。

1.1 試驗材料

將一年生歐亞種‘赤霞珠’（L. ‘Cabernet Sauvignon’）和刺葡萄‘君子1號’（Foex. ‘Junzi 1’）扦插苗種植在塑料盆（直徑14 cm，高度10 cm）中，營養土與珍珠巖比例為4﹕1，培養溫度為22—27℃，濕度為70%—90%，每周澆2次水。移栽3個月后，植株長至10—12片葉，選擇健康無病蟲害、長勢一致的植株進行試驗處理。

1.2 處理方法

將‘赤霞珠’和‘君子1號’植株移至25℃植物培養箱中適應2 d，濕度70%，光照12 000 lx，第3天將植株分別置于35℃、40℃、45℃植物培養箱中連續處理48 h，晝夜16 h/8 h，以25℃培養的植株作為對照，每個處理5盆。

1.3 生理指標的測定方法

1.3.1 相對電導率 采集葡萄植株從基部數第4—6片葉，用打孔器取15個直徑1 cm葉圓片，分別置于3個裝有10 mL超純水的離心管中，每管5個，在150 r/min、25℃的搖床上振蕩3 h，用DDS-307型電導率儀測定初始電導率（E1），然后將裝有樣品的離心管置于水中煮沸30 min，冷卻至室溫測定總電導率（E2），計算相對電導率（%）=E1/E2×100。

1.3.2 相對含水量 采集葡萄植株從基部數第4—6片葉立即稱重，記為鮮重（FW），再將葉片浸入蒸餾水中4 h，取出擦干稱重，記為飽和鮮重（TW），然后將葉片置于80℃烘箱中烘至恒重，記為干重（DW），葉片相對含水量（%）=（FW–DW）/（TW–DW）×100。

1.3.3 葉綠素總量 采集葡萄植株從基部數第4—6片葉，用剪刀將葉片剪成細絲，置于25 mL的容量瓶中，記錄葉片重量；加入0.5 mL純丙酮和15 mL 80%丙酮，室溫下避光浸提過夜；用80%的丙酮定容至25 mL，過濾后用UV-1800型紫外-可見分光光度計分別測定在663 nm和645 nm處的吸光值，計算總葉綠素含量（mg?g-1FW）。

1.3.4 抗氧化酶活性和MDA含量 采集葡萄植株從基部數第4—6片葉，在液氮保護下磨成粉末，裝在2 mL離心管中，每管約0.1 g，在離心管中加入1 mL提取液，搖勻后于8 000×4℃離心15 min，取上清液，置于冰上待測。參照超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒（蘇州科銘）的操作說明進行加樣和反應，用UV-1800型紫外-可見分光光度計測定吸光值，并計算酶活性和MDA含量，每個處理3次重復。

1.3.5 葉綠素熒光參數 用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM2500（Walz，德國）測定葉綠素熒光參數。每個處理選取從基部數第4—6片葉進行測定，測定前將葉片用葉夾夾住，暗適應30 min，然后測定初始熒光（Fo）；用飽和脈沖光（10 000 μmol·m-2·s-1）照射0.5 s，測定最大熒光（Fm）；用500 μmol·m-2·s-1的活化光照射葉片，當Ft穩定后，再次打開飽和脈沖光，測定Fm′；關閉活化光同時打開遠紅光照射5 s，測定Fo′；記錄Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、Fv′/Fm′等參數。

1.3.6 光合參數 每個處理選取從基部數第4—6片葉，在上午9：00—11：00用LI-6800便攜式光合儀（LI-COR，美國）測定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2（Ci）和氣孔導度（Gs）。設定參數為：流速500 μmol·s-1，相對濕度70%，CO2濃度400 μmol·mol-1，風扇速度10 000 r/min，溫度25℃，光強1 800 μmol·m-2·s-1。

1.4 組織化學染色法

1.4.1 超氧陰離子染色

將葡萄葉片浸入到NBT溶液（1 mg·L-1，用pH 7.8的PBS配置）中，抽真空10 min，室溫下放置30 min，葉片出現藍色斑點，將其置于在脫色液（乙醇﹕乙酸﹕甘油=3﹕1﹕1）中，90℃水浴加熱，直至綠色完全脫去，最后將葉片置于蒸餾水中準備拍照。

1.4.2 過氧化氫染色 將葡萄葉片浸入到DAB溶液（1 mg·L-1，pH=3.8—4.0）中，抽真空10 min，在搖床上80 r/min避光振蕩4 h，葉片出現棕色斑點，脫色方法同上。

1.5 掃描電鏡觀察

45℃高溫處理前及處理24 h后，采集植株中部的功能葉片，取主葉脈兩側的部分，用刀片切成5 mm×5 mm的小方塊，將其放在2 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液清洗4次后，用乙醇梯度脫水，然后用乙酸異戊酯置換。將樣品進行干燥、噴金，在S4800場發射掃描電子顯微鏡（日立，日本）下進行觀察和拍照。用300倍照片計算氣孔密度，用5 000倍照片測量氣孔大小和開張程度，每個處理選取10個視野，取平均值，用Photoshop軟件進行測量。

1.6 透射電鏡觀察

45℃高溫處理前及處理24 h后，采集植株中部的功能葉片，取葉片主葉脈兩側的部分，用刀片切成2 mm×5 mm小方塊，將其放在2 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液沖洗樣品，鋨酸固定，再用PBS緩沖液清洗，乙醇梯度脫水，用白膠進行滲透和包埋。用超薄切片機EM UC7（徠卡，德國）切片，將樣品用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用HT7700透射電子顯微鏡（日立，日本）進行觀察和拍照。統計葉綠體和淀粉粒的數量，用Photoshop軟件測量其長度和寬度，每個處理選取10個視野，取平均值。

1.7 數據處理

采用SPSS 21軟件對試驗數據進行方差分析。

2 結果

2.1 高溫對葡萄植株形態的影響

‘赤霞珠’和‘君子1號’在35℃和40℃處理48 h后，植株形態沒有明顯變化，新梢正常生長，葉片邊緣完整，未出現熱害癥狀（圖1）。而在45℃處理后，‘赤霞珠’頂部的2片幼葉呈燒焦狀，其他葉片邊緣有不同程度的卷曲、干枯，葉柄夾角變大，但葉柄顏色正常，未出現壞死癥狀?！?號’在45℃處理后，頂部3片葉完全萎蔫，其余葉片在邊緣和中部均出現壞死斑，值得注意的是‘君子1號’的葉柄在距離葉柄洼約1 cm處的細胞壞死，阻斷了水分向葉片的運輸，加重了葉片的脅迫癥狀。

‘赤霞珠’葉片為5裂，表面平滑；在45℃處理24 h后，葉片從邊緣開始脫水、卷曲、變黃；在處理36 h后，這種現象逐漸向葉片中部擴展；在處理48 h后，葉片90%面積都失去綠色，而葉柄未見明顯的失水癥狀（圖2—A），可見‘赤霞珠’葉片受熱最敏感的部位是葉片邊緣。‘君子1號’葉片呈心形，無裂刻，邊緣鋸齒形，表面平滑有光澤，顏色比‘赤霞珠’深，葉柄有皮刺；在45℃處理24 h后，葉柄從靠近葉片的一端開始出現損傷；在處理36 h后，整個葉柄細胞都脫水死亡，而葉片沒有出現明顯的損傷跡象；在處理48 h后，與葉柄相連的葉脈干枯變褐，葉片上出現大面積的壞死斑（圖2—B）。對‘君子1號’進行多次高溫試驗均發現此現象，可見其葉柄表皮細胞對高溫比較敏感，可能是為了保存莖中的水分，具體原因需進一步研究。

2.2 高溫對電導率、含水量和葉綠素總量的影響

高溫脅迫后，植物細胞膜結構受到不同程度的損傷，導致細胞膜透性增大，細胞內電解質外滲，電導率增大，還會引起葉片含水量的降低和葉綠素的降解。在35℃和40℃處理48 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片的相對電導率、相對含水量和葉綠素總量與對照（25℃）相比均沒有顯著差異；在45℃處理后，二者的相對電導率均顯著升高，而相對含水量和葉綠素總量顯著降低（圖3）。常溫下，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片的相對電導率約為20%，在45℃處理后，二者相對電導率分別升至22.43%和34.18%，說明‘君子1號’的細胞膜損傷程度比‘赤霞珠’更嚴重?！嘞贾椤汀?號’葉片的相對含水量在25℃下分別為88.34%和89.27%，在45℃處理后分別降至對照的75.94%和67.09%，‘君子1號’細胞失水更為嚴重。高溫脅迫會抑制葉綠素合成相關酶的活性，從而降低葉綠素含量。在25℃、35℃、40℃條件下，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片中葉綠素總量均大于2.5 mg·g-1FW，而45℃處理后二者葉綠素總量分別為1.61和1.48 mg·g-1FW，與對照相比分別降低了41.67%和48.07%，‘君子1號’葉片中葉綠素總量的降低幅度更大。

2.3 高溫對抗氧化酶活和MDA含量的影響

‘赤霞珠’葉片中SOD酶活性隨著處理溫度的升高而增加，40℃處理后，‘君子1號’葉片中SOD酶活顯著高于35℃處理，但與45℃處理無顯著差異。‘赤霞珠’葉片中POD酶活性的大小順序為40℃＞35℃＞25℃，45℃處理后POD酶活與40℃處理無顯著差異；‘君子1號’葉片中POD酶活隨溫度升高顯著增加，且相同溫度處理后‘君子1號’POD酶活大于‘赤霞珠’。‘赤霞珠’葉片中CAT酶在40℃處理后活性最高，其次為45℃和35℃處理，高溫處理后CAT酶活顯著高于對照；‘君子1號’葉片中CAT酶在35℃處理后活性最高，其次是40℃處理，45℃處理后CAT酶活與對照無顯著差異。隨著處理溫度的升高，葉片中MDA含量顯著上升，且高溫處理后，‘君子1號’葉片中MDA含量高于‘赤霞珠’（圖4）。

2.4 高溫處理對和H2O2含量的影響

隨著處理溫度的升高，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片上的藍色斑點增多，說明含量有所增加（圖5）。在35℃處理后葉片上幾乎看不到藍色斑點；在40℃處理后，‘赤霞珠’葉片邊緣分布有藍色斑點，而‘君子1號’葉片上的斑點零星分布；在45℃處理后，‘赤霞珠’整個葉片布滿藍色斑點，而‘君子1號’葉片上的斑點數量明顯少于‘赤霞珠’。結合植株形態，‘君子1號’受脅迫的程度高于‘赤霞珠’，但在45℃處理后，‘君子1號’葉片中含量卻低于‘赤霞珠’，有可能是在處理48 h時測定，已經錯過了含量高峰?！嘞贾椤汀?號’葉片中H2O2含量隨處理溫度的升高而增加，45℃處理后，‘君子1號’葉片上布滿大量棕色斑點（圖6），說明在葉片中積累了大量H2O2。

A：赤霞珠；B：君子1號A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1

A：赤霞珠；B：君子1號A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1

不同小寫字母表示差異顯著，P＜0.05。下同

圖4 高溫處理對葡萄葉片中抗氧化酶活性和MDA含量的影響

圖6 高溫處理48 h后葉片H2O2染色

2.5 高溫對葉綠素熒光參數的影響

光合作用對溫度比較敏感，高溫會破壞葉片PS II，通過檢測葉綠素熒光可以了解植物的光合狀況，其參數變化可以用來評價植株的抗逆性。在35℃和40℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片的Fo、Fm、Fv/Fm和ΦPS II與對照相比均無顯著差異，只有在45℃處理后各參數受到不同程度的影響（圖7）。Fo表示最小熒光，是PSⅡ反應中心完全開放時的熒光產量。45℃處理后，‘赤霞珠’葉片Fo值沒有顯著變化，而‘君子1號’葉片Fo值為465.67，顯著高于對照（311.67），Fo值上升的主要原因是PS II反應中心的失活。Fm表示最大熒光，是PS II反應中心完全關閉時的熒光產量。45℃處理后，‘赤霞珠’葉片Fm值沒有顯著變化，而‘君子1號’葉片Fm值為1 159.33，顯著低于對照（1 535.33）。Fv/Fm表示暗適應下PS II最大光化學效率，反映PS II反應中心最大光能轉換效率。常溫下Fv/Fm值為0.8左右，當植物受到脅迫時Fv/Fm會降低。在25℃時，‘赤霞珠’和‘君子1號’Fv/Fm分別為0.780和0.798，45℃處理后，二者Fv/Fm顯著下降，分別降至0.733和0.598，‘君子1號’降低幅度更大。ΦPS II表示在光照條件下PS II反應中心部分關閉后的實際光化學效率，反映葉片在光下用于電子傳遞的能量占吸收光能的比例。45℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片ΦPS II比對照分別降低了56.41%和74.42%，說明高溫抑制了植物的實際光化學效率。

圖7 高溫處理對葡萄葉綠素熒光參數的影響

2.6 高溫對光合參數的影響

在高溫處理48 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導度（Gs）變化趨勢相同，隨著溫度升高而降低（圖8）。在35℃處理后，‘赤霞珠’葉片胞間CO2（Ci）沒有顯著變化，而‘君子1號’Ci顯著降低；在40℃處理后，二者Ci值均顯著降低，而在45℃處理后，Ci值又有所回升。說明35℃和40℃處理后，Pn降低是由氣孔因素導致，而45℃處理后的Pn降低是由非氣孔因素導致。

2.7 高溫對葡萄葉片氣孔特性的影響

由于45℃高溫48 h處理后，細胞結構破壞嚴重，所以取處理24 h的葉片進行掃描電鏡和透射電鏡的觀察。掃描電鏡結果顯示，在45℃高溫處理24 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號’的氣孔開張度明顯減小（圖9），這樣可以緩解高溫導致的水分散失。

常溫下，‘赤霞珠’和‘君子1號’氣孔開張度分別為3.44 μm和1.97 μm，在45℃高溫處理24 h后，二者氣孔開張度顯著降低，分別降低了38.66%和38.07%（表1）。高溫對‘赤霞珠’氣孔長度和寬度無顯著影響，而‘君子1號’氣孔長度和寬度在高溫處理24 h后有所降低，但差異不顯著。氣孔密度不受高溫處理的影響，‘赤霞珠’和‘君子1號’的氣孔密度范圍分別是177.60—187.35個/mm2和122.95—132.71個/mm2。由表1可知，常溫下‘赤霞珠’的氣孔大小、氣孔開張度和氣孔密度均大于‘君子1號’。

圖8 高溫處理對葡萄光合參數的影響

圖9 45℃高溫處理對葡萄葉片氣孔形態的影響

2.8 高溫對葡萄葉綠體結構的影響

常溫下，葡萄葉綠體呈梭形，緊貼細胞膜生長，葉綠體膜完整，基粒片層清晰可見，表面附著少量淀粉粒和嗜鋨顆粒（圖10）。高溫處理后，葡萄葉綠體體積變大，形狀變圓，葉綠體膜出現解體，基粒片層斷裂甚至解體，出現大量巨型淀粉粒，而且由于液泡膜的破壞，葉綠體向細胞內部移動；同時在‘君子1號’葉綠體上觀察到大量嗜鋨顆粒，可加速葉綠體老化。由此可見，高溫下‘君子1號’葉綠體結構變化較明顯。

A：赤霞珠；B：君子1號。Chl：葉綠體；S：淀粉粒；P：嗜鋨顆粒A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1. Chl: Chloroplast; S: Starch grain; P: Plastoglobule

表1 45℃高溫處理對葡萄葉片氣孔特性的影響

不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different small letters mean significant differences (＜0.05). The same as below

在45℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’的葉綠體數目和長度與對照相比無顯著差異，但葉綠體的寬度顯著增加，分別增加了29.04%和75.61%（表2），說明高溫使葉綠體體積變大，形狀變圓（圖10）。高溫處理后，葉綠體表面的淀粉粒數目顯著增加，而且淀粉粒的體積也隨之增大?！嘞贾椤牡矸哿ｉL度平均增加均0.62 μm，寬度平均增加約0.38 μm，而‘君子1號’淀粉粒體積變化更大，其長度和寬度分別平均增加約1.26 μm和0.94 μm（表2）。由此可知，高溫下‘赤霞珠’葉綠體結構的穩定性高于‘君子1號’。

表2 45℃高溫處理對葡萄葉片中葉綠體和淀粉粒的影響

3 討論

3.1 高溫影響葡萄抗氧化酶活性

高溫脅迫會誘導植物體產生ROS，為避免ROS對生物膜及其他大分子物質的傷害，植物體內抗氧化酶系統發揮積極的作用。SOD、POD和CAT是植物體內重要的抗氧化酶，SOD可以將轉化為H2O2和O2，而POD和CAT可以進一步將H2O2分解為H2O和O2[3]。這3種酶可在一定程度上清除體內過剩的ROS，維持ROS代謝平衡，保護膜結構，使植物具有抵抗逆境脅迫的能力。但是當脅迫超過植物的承受極限時，SOD、POD和CAT活性會下降或結構受到破壞，膜脂過氧化程度加劇，細胞的正常代謝和植物生長受到抑制。在本研究中，高溫處理后，葡萄葉片中SOD、POD和CAT酶活均高于對照，SOD和POD在45℃處理后活性最高，而CAT在35℃或40℃處理后活性最高。Zou等[17]對耐熱性不同的兩種油菜進行高溫處理，結果顯示中度高溫脅迫（30℃和35℃）可以激活SOD和POD，但重度高溫脅迫（40℃）會抑制這兩種酶的活性，而35℃處理后CAT酶活顯著低于對照，說明與SOD和POD相比，CAT酶對高溫更敏感，與本研究結果一致。油菜耐熱品種WS-1的3種酶活性在不同溫度下均高于不耐熱品種WS-6，而在本研究中，‘赤霞珠’（耐熱）SOD和CAT酶活高于‘君子1號’（不耐熱），而且與POD酶活性相比，‘赤霞珠’SOD和CAT酶活的增加幅度較大，說明SOD和CAT在葡萄高溫響應過程中發揮重要作用。田治國等[18]研究發現高溫脅迫提高了孔雀草和萬壽菊SOD、POD和CAT的活性，而且耐熱品種3種酶活性的增幅高于不耐熱品種，SOD和POD變化幅度大于CAT，可見孔雀草和萬壽菊在高溫脅迫下SOD和POD在清除ROS方面起主要作用。Zhou等[19]對兩個番茄品種進行高溫處理，結果顯示在處理第3天，兩個品種的SOD和APX活性顯著升高，而CAT活性顯著降低。由此可見，高溫脅迫下植物抗氧化酶的活性受到物種、品種、處理時間、處理溫度等因素的影響。

在實際生產中，人們可以對植物進行預處理以提高抗氧化酶活性，從而提高植株對高溫的抗性。孫軍利等[20]以二年生‘克瑞森’無核葡萄為材料，研究外源水楊酸對高溫脅迫下抗氧化酶和抗氧化劑含量的影響，結果表明外源水楊酸促進了高溫脅迫下葡萄葉片中抗壞血酸和谷胱甘肽的積累，并維持較高的抗氧化酶活性，包括谷胱甘肽還原酶（GR）、APX、SOD、POD和CAT，從而降低高溫脅迫下ROS對植株的傷害。H2O2預處理也可以顯著提高高溫下黃瓜葉片的抗氧化酶活性，包括脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、GR、SOD和APX，從而降低膜脂過氧化程度，保護葉綠體結構免受高溫破壞[21]。Huang等[22]研究發現在營養液中添加30 mmol·L-1葡萄糖，高溫下黃瓜葉片抗氧化酶的活性顯著提高，同時、、、等基因表達量顯著增加，從而抑制了ROS的積累，緩解了高溫對植株生長的抑制作用。

3.2 高溫影響葡萄光合作用

本研究發現，35℃和40℃對‘赤霞珠’和‘君子1號’的植株形態、葉片相對電導率、相對含水量、葉綠素總量和葉綠素熒光參數均沒有顯著影響，但是光合參數卻隨著處理溫度的升高而降低。Fo值可以反映PS II反應中心的損傷程度，Fo值越高，說明損傷程度越大。在35℃和40℃處理48 h后，Fo值與對照無顯著差異，說明PS II反應中心并沒有受到高溫損傷，但是Pn值卻顯著低于對照，推測由氣孔因素導致，而Ci值顯著降低也證明了這一點。在45℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號’的植株形態、葉片相對電導率、相對含水量、葉綠素總量、葉綠素熒光參數和光合參數均發生了顯著變化，Fo值顯著上升說明了PS II反應中心失活，直接導致Pn值的下降，同時Ci值上升，說明45℃下光合速率的降低由非氣孔因素導致。羅海波等[14]對‘赤霞珠’在每日9：30—15：30進行40℃處理，其余時間為30℃，研究發現葡萄葉片光合速率顯著下降，在常溫下1 d可以恢復，作者認為40℃下Pn下降不是氣孔因素導致，主要與PS II供體側和反應中心活性以及激發能的分配有關。這個結果與本試驗結果不一致，可能與處理方式、光照強度等因素有關。查倩等[5]對‘夏黑’進行35℃和45℃高溫處理，處理時間為10：00—16：00，結果顯示在處理6 h后，Fv/Fm值在35℃下無顯著變化，而在45℃下顯著降低，與本試驗結果一致。值得注意的是，在45℃處理150 h后，Fv/Fm又恢復至原初水平，推測‘夏黑’具有較強的高溫適應能力。韓曉等[23]評價8種砧木對‘87-1’葡萄光合特性和葉綠素熒光特性的影響，結果表明‘87-1’/‘SO4’、‘87-1’/‘華葡1’號在不同溫度下凈光合速率變化較小，在高溫下凈光合速率較大，說明SO4和華葡1號兩種砧木可以提高‘87-1’的耐熱性。

本研究使用的兩個葡萄品種為歐亞種，‘赤霞珠’是世界上廣泛種植的釀酒葡萄品種，原產自法國波爾多，能適應各種不同的氣候條件，在我國新疆等炎熱產區具有良好的表現；刺葡萄是我國的野生葡萄品種，廣泛分布在我國南方地區，生于山坡、溝谷疏林或灌叢中，具有較強抗病能力。研究結果表明，‘赤霞珠’的耐熱性顯著高于‘君子1號’，可能由于刺葡萄比較適合高溫高濕的環境，能耐受的絕對溫度沒有‘赤霞珠’高。徐洪國[16]將葡萄離體葉片在47℃下處理40 min后測定Fv/Fm值，用以區分不同品種的耐熱性，結果顯示刺葡萄和‘赤霞珠’的Fv/Fm值分別為0.68和0.63，刺葡萄的耐熱性應該高于‘赤霞珠’，與本研究結果不一致。這可能由于試驗方法不同，或者是由于刺葡萄分為很多品系，不同品系的耐熱性有所不同。在今后的試驗中可以設計不同濕度的高溫處理，對歐亞種和刺葡萄的高溫響應進行比較和研究。

另外，本試驗用調制式葉綠素熒光儀只能了解PS II的總體特征，而不能了解PS II各個部分的具體變化情況，包括供體側、反應中心和受體側。在下一步試驗中，可以用植物效率分析儀測定快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP），以獲得更多的PS II光化學信息，進一步探討葡萄在高溫脅迫下光合作用的變化機理。

3.3 高溫影響葡萄氣孔特性

氣孔是植物葉片上的孔狀結構，是植物進行氣體交換的重要器官。植物葉片通過改變氣孔開張度、大小、密度和空間分布格局等特性來優化氣體交換效率。本研究中，45℃高溫處理后‘赤霞珠’和‘君子1號’葉片的氣孔密度和氣孔大小無顯著變化，而氣孔開張度顯著降低。在高溫條件下，植物通過減小氣孔開張度或者關閉部分氣孔來減少葉片的水分散失。高溫處理后，北高叢越橘‘布里吉塔’和‘藍豐’的氣孔長度、寬度和密度均顯著降低[24]，與本研究結果不一致，可能與品種、溫度、處理方式等因素有關。有研究者認為耐熱品種比不耐熱品種氣孔密度高，使蒸騰作用加強，有效降低葉片表面的溫度，使葉片組織免受高溫傷害[25]。本研究發現‘赤霞珠’葉片的氣孔密度顯著大于‘君子1號’，這可能是‘赤霞珠’耐熱性高的原因之一。

3.4 高溫影響葡萄葉綠體結構

葉綠體對高溫脅迫比較敏感，在高溫條件下葉綠體會產生ROS，如果不能及時清除，會導致葉綠體膜及類囊體膜的解體[26]。本研究中2個葡萄品種的葉綠體在高溫脅迫后受到不同程度的損傷，表現為葉綠體膨脹、基粒片層斷裂、葉綠體膜解體、淀粉粒和嗜鋨顆粒增多、變大。黃瓜在受到高溫脅迫后葉綠體會發生腫脹，異常葉綠體占總數的71.4%，而H2O2預處理可以顯著降低高溫導致的異常葉綠體的比例（33.3%）[21]。北高叢越橘受到高溫脅迫后，葉綠體腫脹為近圓形，葉綠體內出現較多的淀粉粒和嗜鋨顆粒[27]，與本研究結果一致?！嘞贾椤~片受到鹽脅迫后，葉綠體也會發生類似變化[28]，但產生這一現象的原因尚不明確。

光合產物主要以蔗糖的形式通過韌皮部向外運輸，也有一部分同化產物以淀粉的形式在體內積累。在高溫處理后植株韌皮部胼胝體增多，堵塞維管束，影響同化產物在韌皮部的運輸，從而導致淀粉粒的積累[29]。在常溫下，葉綠體內嗜鋨顆粒處于動態平衡中；在高溫條件下，葉綠體或類囊體的膜脂被ROS氧化從而形成嗜鋨顆粒，所以嗜鋨顆粒的大小和數量可以反映葉綠體膜脂過氧化的程度[30]。在本研究中，在高溫處理后‘君子1號’葉綠體表面出現大量嗜鋨顆粒，說明其葉綠體膜脂過氧化程度大于‘赤霞珠’。

葉綠體是光合作用的場所，高溫會導致葉綠體超微結構的變化和光合機構的破壞，從而影響植株的光合作用。在本研究中，‘君子1號’葉綠體結構在高溫下的穩定性較差，這也許是其光合速率降低的主要原因之一。植物的耐熱性是多基因控制的數量性狀，具體反映在植物的組織解剖結構、氣孔特性、細胞器變化、膜脂過氧化程度、抗氧化酶等方面。要準確評價植物的耐熱性，需要綜合考慮形態結構、生理生化、遺傳等因素，并參考植株田間受害及受害后恢復狀況，最終得出結論。

4 結論

通過抗氧化酶、光合參數等指標的測定和植株形態、氣孔形態、葉綠體結構的觀察，確定‘赤霞珠’的耐熱性顯著大于‘君子1號’。在中度高溫脅迫下（35℃和40℃），‘赤霞珠’和‘君子1號’的PSII活性中心未發生不可逆損傷，凈光合速率（Pn）降低由氣孔因素導致；而在重度高溫脅迫下（45℃），‘君子1號’PSII活性中心的損傷程度大于‘赤霞珠’，Pn降低由非氣孔因素導致?！嘞贾椤臍饪酌芏却螅~綠體結構穩定，高溫處理后超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性大幅增加是其耐熱性高的重要原因。

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Effects of Heat Stress on Physiological Indexes and Ultrastructure of Grapevines

LIU Min1,2, FANG Yulin1,3

(1College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;3Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, Shaanxi)

【】 The objective of this research was to study the effects of heat stress on physiological indexes and ultrastructure of grapevines, and to explore the physiological response mechanism of grapevines to heat stress. 【】One-year cutting seedlings ofL. cv. Cabernet Sauvignon andFoex. cv. Junzi 1were used as test materials, which were treated at 35℃, 40℃ and 45℃ for 48 h, with the plants at 25℃ as the control. Relative electrolyte leakage, relative water content, total chlorophyll content, antioxidant enzyme activity, malondialdehyde/super oxygen anion/hydrogen peroxide content, chlorophyll fluorescence and photosynthetic parameters of grape leaves were detected. By the scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), stomatal morphology and chloroplast ultrastructure were observed. 【】After heat treatment at 35℃ and 40℃, the plant morphology, relative electrolyte leakage, relative water content, total chlorophyll content and chlorophyll fluorescence of Cabernet Sauvignon and Junzi 1 showed no significant changes, but net photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr) and stomatal conductance (Gs) were significantly reduced. After heat treatment at 45℃, Cabernet Sauvignon and Junzi 1 appeared stress symptoms, with relative electrolyte leakage increasing, and relative water content, total chlorophyll content, Fv/Fm, ΦPSII, Pn, Tr and Gs decreasing. The change range of each parameter in Junzi 1 was greater than that in Cabernet Sauvignon. With the increase of temperature, malondialdehyde/superoxide anion/hydrogen peroxide content, SOD and POD activities in grape leaves increased continuously, while CAT activity was the highest under moderate heat stress. The increase of SOD and CAT activities in Cabernet Sauvignon leaves was greater than that in junzi 1. By SEM, it was found that at room temperature, the stomatal density of Cabernet Sauvignon was higher than that of Junzi 1; after heat treatment, the stomatal opening of grape leaves decreased, but the stomatal size did not change significantly. By TEM, it was found that after heat treatment, the chloroplast became large and round; the chloroplast membrane disintegrated; many giant starch grains appeared; a large number of plastoglobules were observed in the chloroplast of Junzi 1. 【】In Cabernet Sauvignon, stomatal density was high, chloroplast structure was stable, and SOD and CAT activities highly increased after heat treatment, which were the important reasons for its high heat resistance.

Cabernet Sauvignon;Foex. cv. Junzi 1; heat stress; photosynthesis; antioxidant enzyme; chloroplast

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.013

2019-08-27；

2019-10-30

陜西省重點研發項目（2018ZDXM-NY-053）、國家現代農業（葡萄）產業技術體系建設專項（CARS-29-zp-06）、釀酒葡萄輕簡化高效栽培技術集成與示范（2018E02050）

劉敏，E-mail：liumin272@163.com。通信作者房玉林，E-mail：fangyulin@nwsuaf.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）