轉基因油菜篩查陽性質粒分子的研制及應用

李俊，李夏瑩，王顥潛，翟杉杉，陳子言，高鴻飛，李允靜，吳剛，張秀杰，武玉花

轉基因油菜篩查陽性質粒分子的研制及應用

李俊1，李夏瑩2，王顥潛2，翟杉杉1，陳子言2，高鴻飛1，李允靜1，吳剛1，張秀杰2，武玉花1

（1中國農業科學院油料作物研究所/農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062；2農業農村部科技發展中心，北京 100025）

【】轉基因油菜是四大轉基因作物之一，是中國轉基因生物安全監管的重要對象，轉基因檢測為轉基因安全監管提供技術支撐。轉基因篩查是轉基因檢測的第一步，篩查靶標設置不合理會導致漏檢部分轉基因成分。建立轉基因油菜篩查策略，并研制與篩查策略配套的陽性質粒分子，將為中國的轉基因油菜安全監管提供強有力的技術支撐。通過收集數據庫中登記的轉基因油菜品種的外源基因元件信息，分析轉基因油菜品種中常用的調控元件和標記基因，基于最大篩查覆蓋率原則，確定轉基因油菜的篩查靶標。通過檢索數據庫或查詢專利，收集篩查元件的核苷酸序列。一個篩查元件通常有多個標準方法，查閱各篩查元件的檢測標準，分析各標準中普通PCR引物對和實時熒光PCR引物/探針組合在篩查元件核苷酸序列中的位置，根據引物探針的結合位點，確定擬構建到質粒上的各篩查元件的核苷酸序列。人工合成各篩查元件和油菜內標基因的融合序列，克隆到常用質粒pUC18，構建陽性質粒分子。采用各篩查元件的普通PCR和實時熒光PCR方法，評估陽性質粒分子的適用性。建立了轉基因油菜的篩查策略，通過檢測CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、、、、、、NOS終止子和PinⅡ終止子共9個基因元件，可實現已知信息轉基因油菜品種的全覆蓋。構建出聚合9個篩查元件和2個油菜內標基因和的轉基因油菜篩查質粒分子pYCSC-1905。9個篩查元件和2個油菜內標基因的擴增效率均在90%—110%，證明質粒分子上的不同靶標序列沒有相互干擾，影響PCR的擴增效率。質粒分子pYCSC-1905可用作9個篩查元件和2個油菜內標基因的通用陽性對照，適用于國家標準（GB/T和農業農村部公告）、出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T）和歐盟標準。提出的轉基因油菜篩查策略涵蓋9個基因元件，可實現從商業化到安全評價各階段轉基因油菜的篩查檢測，顯著降低轉基因油菜的篩查漏檢率。研制的配套質粒分子pYCSC-1905為轉基因油菜篩查和各基因元件標準方法的應用提供了通用標準樣品，保證檢測機構間檢測數據的準確性和可比性。

轉基因油菜；篩查；篩查策略；陽性質粒分子；應用

0 引言

【研究意義】轉基因油菜是四大轉基因作物之一，是食用油和飼料餅粕的重要來源，已在加拿大、美國、澳大利亞等國家大規模商業化種植。為了滿足食用油和餅粕供應，中國每年需從國外進口油菜籽，2015年進口量超過500萬噸，其中90%以上為轉基因菜籽。中國也是油菜種植大國，轉基因研究活躍，不斷有品種進入田間試驗階段。轉基因油菜是中國轉基因生物安全監管的重要對象。轉基因篩查檢測是轉基因生物安全監管的第一步，以轉基因作物中常用的啟動子、終止子和目的基因為檢測靶標，通過篩查樣品中常用基因元件的有無，可初步判定樣品中是否含有轉基因成分[1]。在轉基因篩查時，如果設置的篩查靶標不能充分覆蓋已有轉基因產品，會導致部分轉基因產品的漏檢。而且，在進行轉基因篩查檢測時，常常面臨缺乏標準樣品的難題。因此，研究轉基因油菜的篩查檢測策略，并根據篩查靶標研制篩查檢測用陽性質粒分子，對中國的轉基因油菜安全監管具有重大意義。【前人研究進展】2004年，中國批準進口轉基因油菜籽用作加工原料，為了對轉基因油菜進行安全監管，一直大力推動轉基因油菜檢測技術標準體系的建設，現在中國已初步建立起轉基因油菜檢測技術標準體系，包括國家標準（GB/T）[2-3]、農業農村部公告[4-8]、出入境檢驗檢疫行業標準[9-12]等。標準方法主要是基于基因組DNA擴增的PCR方法，檢測靶標包括花椰菜病毒的35S啟動子（P-CaMV35S）、胭脂堿合成酶NOS終止子（T-NOS）等調控元件[4,11]，新霉素磷酸轉移酶基因（）、膦絲菌素乙酰轉移酶基因（）、膦絲菌素乙酰轉移酶基因（）等功能基因[5-13]，以及批準進口的MS8、RF3、GT73等轉化體[11]。雖然針對各個基因元件都發布了標準方法，但在轉基因油菜篩查檢測時，應該檢測哪些靶標，還沒有明確的規定。各家轉基因檢測實驗室在檢測轉基因油菜時，都是自行設置檢測靶標，導致實驗室間的檢測結果缺乏可比性。張麗等[13]曾基于商業化轉基因油菜中基因元件使用頻率的分析，確定了轉基因油菜的篩查檢測策略，認為檢測P-CaMV35S、玄參花葉病毒35S啟動子（P-FMV35S）、、5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因（）、和T-NOS共6個基因元件，可100%檢測出批準進口轉基因油菜品種。劉冰[14]研究認為檢測P-CaMV35S、T-NOS、、、和６個靶標元件的組合，理論上可篩查92%的已知商業化轉基因油菜轉化事件。隨著轉基因油菜新品種的推出，采用這兩個篩查策略均會導致部分轉基因油菜品種發生漏檢。標準物質或標準樣品是進行轉基因檢測的物質基礎，應用標準物質可保證檢測結果的準確性、可靠性和可比性。基體標準物質的研制和生產受原材料供應等方面的限制，而質粒標準分子的研制則不依賴轉基因原材料，因此，質粒標準分子成為基體標準物質的最佳替代品，適宜在轉基因定性檢測中用作陽性標準樣品[15]。迄今為止，中國僅研制出了一個轉基因油菜T45質粒標準物質（GBW（E）100340），該標準物質僅能用于油菜T45轉化體的特異識別和定量，不能用于轉基因油菜篩查檢測。為了滿足轉基因油菜的檢測需求，LI等[16]將RF1、RF2、MS1、MS8、Topas 19/2、Oxy235、RT73和T45共8個轉化體的靶標序列融合構建到一個質粒分子上，研制出一個多靶標的油菜質粒分子，但該質粒分子不能用于轉基因油菜篩查檢測。Wu等[17]將P-CaMV35S、P-FMV35S、胭脂堿合成酶NOS啟動子（P-NOS）、、、潮霉素磷酸轉移酶基因（）、磷酸甘露糖異構酶基因（）、T-NOS、花椰菜病毒的35S終止子（T- CaMV35S）、TL-DNA基因7終止子（T-g7）和E9基因3’終止子（T-e9）11個外源基因元件和玉米、油菜、大豆、棉花、水稻和小麥六大作物內標基因的靶標序列，融合構建到一個質粒上，研制出一個通用的篩查質粒分子，但該分子不是針對轉基因油菜研制，在應用時會導致個別轉基因油菜品種的漏檢。徐俊鋒等[18]構建了油菜篩查質粒分子pMD-rape，以作為油菜內標準基因，攜帶P-CaMV35S、P-FMV35S、花藥組織特異基因TA29啟動子（PTa29）、P-NOS、T-NOS、T-CaMV35S和T-g7 7個檢測靶標序列，覆蓋90%的轉基因油菜品種，但該質粒分子只適用于通過農業部公告發布的標準，不適用于國家標準（GB/T）和出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T）。【本研究切入點】前期研究雖然曾提出轉基因油菜的篩查檢測策略，但存在檢測參數設置不合理導致個別轉化體漏檢的問題。相應地，構建的轉基因油菜篩查質粒分子也只能覆蓋大部分轉基因油菜品種。因此，在轉基因油菜安全監管工作中，現有轉基因油菜篩查策略和篩查用標準樣品均難以滿足現階段檢測需求。【擬解決的關鍵問題】本研究通過分析商業化轉基因油菜和試驗階段轉基因油菜的常用基因元件，提出轉基因油菜的篩查檢測策略，研制轉基因油菜篩查檢測用質粒標準分子，為轉基因油菜的篩查檢測提供陽性對照。進一步完善中國的轉基因油菜檢測、監測技術標準體系，有效發揮標準方法在轉基因生物安全監管中的作用，提高中國對非授權轉基因油菜產品非法擴散的檢測、監測水平，為中國的轉基因生物安全監管提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因油菜標準物質GT73（0304-B2）、RF1（0711-B2）、MS1（0711-A3）、RF2（0711-C2）、MS8（0306-F6）、RF3（0306-G5）、OXY235、T45（0208-A5）、Topas19 /2（0711-D3）、MON88302（1011-A）購自美國油脂化學家協會（American Oil Chemists’ Society，AOCS）；轉基因油菜73496（ERM- BF434b）的標準物質購自歐盟的標準物質與測量研究所（institute for reference materials and measurements，IRMM）。

用pUC18質粒作為標準質粒分子的載體骨架。PCR引物和探針由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 質粒分子構建

確定轉基因油菜篩查元件的核苷酸序列后，將各基因元件的核苷酸序列拼接到一起，送到上海生物工程有限公司人工合成核苷酸序列，將合成的核苷酸序列構建到pUC18質粒分子上。然后對質粒分子進行重測序，確定核苷酸序列的準確性。

1.3 基因組DNA的提取

用Qiagen的基因組DNA提取試劑盒提取標準樣品的基因組DNA。用紫外分光光度計測定所提取基因組DNA的純度和濃度，要求OD260/OD230＞2.0，OD260/OD280為1.8—2.0。

1.4 普通PCR檢測

在普通PCR儀C1000 TouchTM（Bio-rad，USA）上進行PCR反應，PCR反應體系為25 μL，含20 ng基因組DNA、1×PCR buffer、5 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1dNTPs、400 nmol·L-1引物、1單位Taq酶（Takara，Shiga，Japan）。PCR反應程序為94℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 2 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，EB染色后，在凝膠成像儀中觀測結果（Bio-rad，USA）。

1.5 實時熒光PCR檢測

在實時熒光PCR儀CFX96TM上進行實時熒光PCR反應，PCR反應體系為20 μL，含20 ng基因組DNA、1×TaqMan Universal PCR Master Mix（ABI，USA）、400 nmol·L-1引物、200 nmol·L-1探針。反應程序為50℃預酶切2 min；95℃ UNG滅活10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，50個循環。用CFX Manager?軟件（Bio-rad，USA）分析數據。

2 結果

2.1 轉基因油菜產業化和研發現狀分析

查閱國際農業生物技術應用服務組織（The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）的“GMO Approved Database”數據庫（http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/ cropslist/default.asp）和改性活生物體登記（Living Modified Organism (LMO) Registry）數據庫（http://bch.cbd.int/database/lmo-registry），分析轉基因油菜產業化和研發現狀。ISAAA數據庫中可查詢到41個轉基因油菜品種，包括14個復合性狀品種和27個獨立轉化體品種，其中，轉基因油菜Topas 19/2被統計2次，分別對應HCN10和HCN92（表1）。LMO數據庫中登記了55個轉基因油菜品系，有28個轉基因油菜品系未出現在ISAAA數據庫中，其中2個品系含有，6個品系含有，其余品系未提供功能基因和調控元件信息。

表1 ISAAA數據庫中登記的轉基因油菜品種

中國批準了耐除草劑油菜Ms1×Rf1、Ms1×Rf2、Ms8×Rf3、T45、Topas19/2、Oxy-235、GT73、RF3和MON88302 9個品種進口用作加工原料，涉及10個獨立轉化體MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、T45、OXY235、Topas 19/2、GT73和MON88302。在中國曾做過安全評價，但還未批準進口的有2個品種，分別是MS8×RF3×GT73和73496，涉及1個新轉化體73496。

2.2 確定轉基因油菜篩查元件

確定轉基因油菜篩查的基因元件要考慮2個因素，一個是基因元件的使用頻率高；另一個是組合使用不同基因元件可達到最高的品種覆蓋率，最好對已知品種覆蓋率達到100%。統計分析轉基因油菜中使用的基因元件，ISAAA數據庫中有26個獨立轉基因油菜轉化體，能查閱到完整遺傳轉化信息的有19個，包含中國已批準進口的10個轉化體（MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、T45、OXY235、Topas 19/2、MON88302和GT73）和可能將批準進口的轉化體73496。轉基因油菜不育系MS11擬取代MS8，用于商業化生產，但沒有查閱到其完整的遺傳轉化信息。ISAAA數據庫中提供的信息顯示，MS11含有表達框、表達框和表達框。LMO數據庫中另外登記的28個轉化體中有2個轉化體含有，6個轉化體含有，其余轉化體未提供明確的外源元件及基因信息。油菜作為四大轉基因作物之一，中國轉基因研究非常活躍，在1992—2015年間有497篇與轉基因油菜相關的論文發表[19]。在基因工程研究中，除了用、作為選擇標記外，還大量用作為選擇標記。

通過分析查閱到的轉基因油菜品系中常用的外源元件和標記基因的使用頻率，以及常用遺傳轉化載體中含有的調控元件和標記基因，確定用9個基因元件進行轉基因油菜的篩查檢測，分別是（1）P-CaMV 35S、（2）P-FMV 35S、（3）、（4）、（5）修飾的、（6）、（7）T-NOS、（8）馬鈴薯蛋白酶抑制因子Ⅱ終止子（T-PinⅡ）和（9）。9個基因元件在20個已知信息油菜轉化體中的分布如表2所示。對這9個基因元件進行檢測，可實現20個已知轉基因油菜品種、LMO數據庫中已知遺傳轉化信息品種的全覆蓋，批準進口品種覆蓋2—3次。通過將作為檢測參數，可覆蓋部分實驗室研究階段的材料。

表2 9個篩查元件在油菜轉化體中的分布

2.3 確定9個篩查元件的靶標序列

9個篩查元件的完整核苷酸序列信息如表3所示，在轉基因檢測中，每個篩查元件僅有部分核苷酸序列用作檢測靶標，因此，本研究僅將各元件的檢測靶標序列構建到質粒分子中。在確定9個篩查元件的靶標序列時，要求擬構建的質粒分子不僅可用作普通PCR檢測的陽性對照，還可用作實時熒光PCR檢測的陽性對照；不僅適用于農業部發布標準，還適用于GB/T、SN/T和歐盟標準。

查閱9個篩查元件的檢測標準，包括GB/T檢測標準[2-3]、農業農村部發布的檢測標準（農業農村部公告）[4-8]、SN/T檢測標準[9-12]和歐盟標準[20-33]，收集各標準中針對這9個篩查元件的普通PCR方法和實時熒光PCR方法（表3）。分析各標準中普通PCR引物對和實時熒光PCR引物/探針組合在篩查元件核苷酸序列中的位置，確定擬構建到質粒上的各篩查元件的靶標核苷酸序列。選用和作為轉基因油菜內標基因。各篩查元件的靶標序列長度及油菜內標基因和的核苷酸序列信息如表3所示。

2.4 轉基因油菜篩查質粒分子的構建

將9個篩查元件和2個油菜內標基因的靶標序列拼接到一起，獲得一條長4 433 bp的融合序列（圖1）。將融合序列送到上海生工進行全序列人工合成，將人工合成的序列通過RⅤ酶切位點插入pUC18質粒分子中，構建轉基因油菜篩查質粒分子pYCSC-1905（圖2）。然后將構建的轉基因油菜篩查質粒分子pYCSC-1905進行全分子測序，測得的序列與預期序列完全一致。

表3 各篩查元件和油菜內標基因的核苷酸序列、標準方法信息

表中CT-PCR表示普通PCR，RT-PCR表示實時熒光PCR

CT-PCR indicates conventional PCR, RT-PCR indicates real-time PCR

圖1 篩查元件和油菜內標基因融合序列示意圖

圖2 轉基因油菜篩查質粒分子結構示意圖

2.5 轉基因油菜篩查質粒分子的應用

將轉基因油菜GT73、MS1、RF1、MS1、RF2、MS8、RF3、OXY235、T45、Topas19 /2、MON88302和73496的基因組DNA，作為測試樣品，將質粒分子pYCSC-1905設為陽性對照，進行轉基因油菜普通PCR和實時熒光PCR篩查檢測，引物、探針序列見電子附表1。將普通PCR產物進行凝膠電泳分析，各篩查元件和油菜內標基因在陽性對照和相應的轉基因油菜樣品中均擴增出預期產物，在不含有相應元件的樣品中沒有擴增產物（圖4）。實時熒光PCR擴增結果表明，各篩查元件和油菜內標基因在陽性對照和相應的轉基因油菜樣品中均有典型擴增曲線，在不含有相應元件的樣品中沒有擴增曲線（數據未給出）。普通PCR和實時熒光PCR的篩查檢測結果一致，陽性質粒分子pYCSC-1905的每個靶標均獲得預期擴增，實際應用結果進一步證實pYCSC-1905適合用作轉基因油菜普通PCR和實時熒光PCR篩查檢測的質控樣品。

E表示擴增效率，2表示標準曲線的決定系數，slope表示標準曲線的斜率，y-int 表示標準曲線的截距

E indicates amplification efficiency,2indicates regression coefficient, slope indicates the slope of standard curve, y-int indicates the intercept of standard curve

圖3 9個篩查元件和2個油菜內標基因的標準曲線繪制和擴增效率檢測

Fig. 3 Standard curves and amplification efficiencies of nine screening elements and two rapeseed reference genes

3 討論

轉基因生物安全監管一方面要監管批準進口的轉基因產品是否按規定流通和使用；另一方面要監管中國未批準進口的轉基因產品是否非法進入市場或田間。其中，對非法轉基因產品的檢測和監測是轉基因生物安全監管工作的重中之重。非法（非授權）轉基因產品是指未經批準而釋放到市場上的轉基因產品，包括在別的國家批準而在中國并未獲批的轉基因材料、田間非法種植的僅批準進口用作加工原料的轉基因材料，以及尚處于試驗階段的轉基因材料。由于轉基因產品存在潛在的環境和食用安全風險，一旦發生非授權轉基因產品的非法擴散，將擾亂正常貿易秩序，在消費者中引發恐慌情緒，對國民經濟、生活產生一系列的惡劣影響。轉基因檢測是轉基因生物安全監管的技術基礎，在轉基因檢測中盡量降低漏檢轉基因成分的幾率，才能保證轉基因生物安全監管的有效性。

中國轉基因油菜研究活躍，存在很大的非法擴散風險。本研究通過分析轉基因油菜中基因元件的使用，制定出了組合檢測9個基因元件（P-CaMV 35S、P-FMV 35S、、、、、、T-NOS、T-PinⅡ）對轉基因油菜進行篩查檢測的策略，采用本篩查策略可以覆蓋已知信息的轉基因油菜品種，并且通過篩查，最大程度覆蓋了試驗階段的轉基因產品。為了給篩查檢測提供通用的標準樣品，本研究還研制出了轉基因油菜篩查質粒分子pYCSC-1905，本質粒分子可為不同的標準方法提供陽性對照，包括農業部公告、GB/T、SN/T和歐盟標準中涉及的普通定性PCR方法和實時熒光PCR方法，具有良好的廣適性。組合使用本研究建立的轉基因油菜篩查策略和篩查陽性質粒分子pYCSC-1905，不僅可篩查出中國批準進口的轉基因油菜，還可篩查出非授權的轉基因油菜品種。

M：marker；1：p-YCSC-1905；2：T45；3：GT73；4：MS8；5：MS1；6：RF1；7：RF2；8：RF3；9：OXY235；10：Topas 19/2；11：73496；12：MON88302；13：陰性對照中油821；14：空白對照

4 結論

建立了轉基因油菜篩查策略，并研制出與轉基因油菜篩查策略配套的陽性質粒分子pYCSC-1905，為轉基因油菜篩查和各基因元件標準方法的使用提供了一個通用標準樣品。本篩查策略實現了目前已知信息轉基因油菜品種的全覆蓋，降低了轉基因油菜篩查檢測中漏檢個別品種的幾率。

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Development and Application of Plasmid Reference Molecule for Genetically Modified Rapeseed Screening

LI Jun1, LI Xiaying2, WANG Haoqian2, ZHAI Shanshan1, CHEN Ziyan2, GAO Hongfei1, LI Yunjing1, WU Gang1, ZHANG Xiujie2, WU Yuhua1

(1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crop, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;2Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025)

【】 Rapeseed is one of the four major genetically modified (GM) crops, the production and application of GM rapeseed must be regulated in China. Performance of GMO detection is the prerequisite to implement GMO regulations, screening is the first step to determine the presence or absence of GMO ingredients in testing samples. Appropriate selection of screening targets can effectively reduce the chance of missed detection of some GM ingredients. A technical platform, involving establishment of screening strategy for GM rapeseed and development of a common reference plasmid that is compatible with the screening strategy, would provide technical support for regulating GM rapeseed.【】 Both regulatory elements and marker genes commonly used in GM rapeseed are obtained by collecting and analyzing the GM rapeseed varieties registered in database, then the screening strategy for GM rapeseed can be determined based on the principle of maximum coverage of GM rapeseed varieties. The whole nucleotide sequences of screening elements are collected by searching nucleotide database or retrieving patent. One screening target usually has multiple standard detection methods, both the primer pairs for conventional PCR and the primers/probe combinations for real-time PCR are aligned with the nucleotide sequence of each screening target to determine the target sequence that would be integrated into plasmid. The fusion sequence of all screening elements together with rapeseed reference genes was artificially synthesized, and cloned into the plasmid pUC18 to construct a positive plasmid molecule. Both conventional PCR and real-time PCR are utilized to evaluate the applicability of constructed plasmid as positive control.【】 The screening strategy for transgenic rapeseed was established by detecting nine elements, involving two promoters of CaMV 35S and FMV 35S, five genes of,,,, and, two terminators of NOS and PinII. This screening strategy achieved full coverage of transgenic rapeseed varieties with known information. The screening plasmid pYCSC-1905 was constructed for GM rapeseed, carrying nine screening elements and 2 rapeseed reference genes ofand. The amplification efficiencies of nine screening elements and two rapeseed reference genes were in the range from 90% to 110%, demonstrating that the amplification efficiency of screening target is not influenced due to the mutual interference of integrated fragments. The plasmid pYCSC-1905 can be used as a common positive control for nine screening targets and two rapeseed reference genes, applicable to national standards (GB/T and Declaration of Ministry of Agriculture and Rural Affairs), Entry-exit inspection and quarantine industry standards (SN/T) and European Union standards.【】The screening strategy covering 9 elements for GM rapeseed screening , can achieve the screening of GM rapeseed in all stages from commercialization to safety assessment, and significantly reduce the missed detection of GM rapeseed. The developed plasmid pYCSC-1905 provides a general positive control for rapeseed screening and the standard methods, and ensures the accuracy and comparability of test results between laboratories.

genetically modified rapeseed; screening; screening strategy; positive plasmid molecule; application

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.003

2019-08-07；

2019-11-13

轉基因生物新品種培育專項（2016ZX08012003）、國家自然科學基金（31601581）

李俊，E-mail：lijuner126@126.com。通信作者張秀杰，E-mail：zhxj7410@sina.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

（責任編輯 李莉）