地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查和診斷方法進(jìn)展與評(píng)價(jià)

鄭慕陽

（廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

地中海貧血為臨床常見的血液系統(tǒng)疾病，屬隱性遺傳性血液疾病的一種，由構(gòu)成紅血球基因失常所導(dǎo)致。根據(jù)基因受累情況的不同，可將地中海貧血分為α型與β型兩種。該疾病包括輕度、中度、重度三種。輕度地中海貧血患者，一般無明顯癥狀，部分患者偶爾可感到體力下降。隨著病情的加重，癥狀逐漸明顯，嚴(yán)重甚至可導(dǎo)致壽命縮短。如夫妻雙方均為同型基因攜帶者，胎兒罹患重癥地中海貧血的幾率為25%左右，疾病目前尚無有效的治療方法，因此，積極給予預(yù)防是關(guān)鍵。臨床研究發(fā)現(xiàn)，地中海貧血的發(fā)生，與遺傳以及基因因素有關(guān)。在我國，廣東及廣西地區(qū)人群以客家人為主，兩地區(qū)為地中海貧血的高發(fā)區(qū)域。及早篩查并診斷，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的預(yù)防與控制，對(duì)我國新生人口質(zhì)量的提升，具有積極意義。為達(dá)到上述目的，全面改善居民的健康狀況，本文對(duì)地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查和診斷方法進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)與評(píng)價(jià)。

1 地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查方法

地中海貧血實(shí)驗(yàn)室篩查方法，包括紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)、血紅蛋白組分分析、血常規(guī)篩查方法三種，三者的原理、優(yōu)勢與缺陷，主要體現(xiàn)在以下方面。

1.1 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn) 采用紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)篩查地中海貧血，效果值得肯定[1]。該實(shí)驗(yàn)原理在于利用紅細(xì)胞的滲透特征，觀察血液標(biāo)本有無異常[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，地中海貧血患者中，90%以上者均伴有紅細(xì)胞脆性下降現(xiàn)象，脆性低的紅細(xì)胞，進(jìn)入低滲鹽水溶液中，可發(fā)生膨脹，繼而破裂[3]。因此，實(shí)驗(yàn)中，如發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞膨脹破裂，則可判斷患者可能伴有地中海貧血[4]。該篩查方法的優(yōu)勢，在于簡單便利，但特異性低，部分肝病患者，血液標(biāo)本檢查時(shí)同樣可見該現(xiàn)象[5]。

1.2 血紅蛋白組分分析 血紅蛋白組分分析，同樣為臨床用于篩查地中海貧血的主要手段。最初，淀粉膠電泳-濾紙電泳，為血紅蛋白組分分析的關(guān)鍵技術(shù)，但該技術(shù)篩查方法不盡人意[6]。隨著醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的發(fā)展，醋酸纖維膜電泳法出現(xiàn)，雖提高了檢出率，但假陽性率較高，且具有分辨率低的缺陷。目前，臨床所應(yīng)用的血紅蛋白組分分析方法，以高效液相色譜法為主[7]。該方法具有精確度高、操作簡單的優(yōu)勢，且有助于分辨主要變異體，但因檢測成本高，故難以在所有醫(yī)院普及[8]。

1.3 血常規(guī)篩查方法 血常規(guī)檢測，具有便利、簡單、成本低廉的優(yōu)勢，臨床常采用該方法篩查地中海貧血[9]。采用該方法篩查疾病，臨床需對(duì)HGB、MCV以及MCH、PLT等項(xiàng)目數(shù)值進(jìn)行觀察。地中海貧血患者，往往可見MCV水平下降（一般為82 g/L以下）、MCH水平下降（一般為27 pg以下）[10]。但需注意的是，部分缺鐵性貧血患者，血常規(guī)檢測同樣可見上述現(xiàn)象。因此，建議臨床結(jié)合血清鐵等指標(biāo)，輔助篩查疾病，以免發(fā)生誤診，對(duì)患者疾病的治療造成延誤[11]。

2 地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷方法

本部分主要?dú)w納了ARMS、PCR、PCR-SSCP、PCRRFLP、PCR-RDB、熒光定量PCR以及ASO技術(shù)等地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷方法的特點(diǎn)與應(yīng)用方法，并對(duì)其優(yōu)勢及缺陷進(jìn)行了對(duì)比。

2.1 ARMS ARMS為臨床診斷地中海貧血的常用方法，又稱多重?cái)U(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方法診斷的準(zhǔn)確率，與反應(yīng)條件的變化有關(guān)[12]。為解決上述問題，部分學(xué)者指出，可將甲酰胺加入反應(yīng)過程中。臨床實(shí)驗(yàn)表明，采用ARMS診斷地中海貧血，設(shè)計(jì)4條引物，可實(shí)現(xiàn)對(duì)HbCS以及HbQS的擴(kuò)增，判斷兩者是否存在突變，提高疾病檢出率[13]。ARMS技術(shù)，具有檢測便利性強(qiáng)的特點(diǎn)，且效率較高。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用到了臨床，并發(fā)揮了巨大的價(jià)值[14]。另外，采用ARMS技術(shù)診斷時(shí)，臨床僅需提取患者微量DNA樣本，便可有效檢測，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較為簡單，無需對(duì)分子進(jìn)行雜交，無需對(duì)放射性核素進(jìn)行觀察，此為ARMS技術(shù)的主要優(yōu)勢。該技術(shù)用于診斷地中海貧血，同樣具有一定的缺陷，主要體現(xiàn)在特異性低方面，診斷時(shí)，易出現(xiàn)假陽性與假陰性問題，可能發(fā)生誤診或漏診。

2.2 PCR PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，強(qiáng)調(diào)利用DNA聚合酶的功能，作用于成對(duì)引物，使兩者的特異性DNA片段得到催化，從而達(dá)到體外擴(kuò)增的目的[15]。有學(xué)者在研究中指出，該診斷方法的應(yīng)用，雖可取得較好的效果，但如將其與OR法結(jié)合，則可更加準(zhǔn)確的檢出基因突變型，進(jìn)一步提升地中海貧血陽性率[16]。熒光PCR為近年來出現(xiàn)的地中海貧血診斷技術(shù)，與普通PCR相比，敏感度可高出1000倍以上，實(shí)現(xiàn)對(duì)正常基因、雜合子、純合子的辨別。目前，熒光PCR在國內(nèi)各大醫(yī)院已有所應(yīng)用。通過對(duì)胎兒羊水或臍帶血的檢測，可及早發(fā)現(xiàn)地中海貧血發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 PCR-SSCP PCR-SSCP又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈接構(gòu)象多態(tài)性分析，與PCR法相比，該方法要求在DNA體外擴(kuò)增后，給予單鏈DNA多態(tài)性分析[17]。采用該方法診斷，有助于供臨床掌握患者的突變情況。近些年來，測序技術(shù)已出現(xiàn)并被應(yīng)用到了臨床，故PCR-SSCP法在地中海貧血診斷中的應(yīng)用頻率逐漸下降。PCR-SSCP診斷地中海貧血，優(yōu)勢在于無放射性核素污染，安全性較強(qiáng)，且有助于使臨床及早發(fā)現(xiàn)未知點(diǎn)突變。此診斷方法的缺陷在于，對(duì)PCR產(chǎn)物的要求較高，如產(chǎn)物＜200 bp，則突變檢出率一般為70%-90%。臨床可根據(jù)該方法的特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行選擇。針對(duì)產(chǎn)物＞200 bp者，可考慮選擇PCR-SSCP法診斷。

2.4 PCR-RFLP PCR-RFLP又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶酶譜檢測，強(qiáng)調(diào)于DNA體外擴(kuò)增后，對(duì)其內(nèi)切酶進(jìn)行消化，繼而通過電泳的方式，判斷基因有無突變。該診斷方法的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在操作較為簡單方面。采用PCR-RFLP診斷地中海貧血時(shí)，如用于檢測小片段缺失及內(nèi)切酶點(diǎn)改變，效果較好[18]。但單獨(dú)采用該技術(shù)診斷，無法直接測出基因突變型，需聯(lián)合使用探針，方可最終確診。可見，此法診斷地中海貧血，具有一定的局限性，難以推廣應(yīng)用。因此，目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶酶譜檢測法在臨床的應(yīng)用較少。

2.5 PCR-RDB PCR-RDB又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-寡核苷酸探針反向斑點(diǎn)雜交，要求利用探針，對(duì)DNA進(jìn)行提取，在此基礎(chǔ)上，通過一次性雜交的方式，觀察有無基因突變。PCRRDB診斷的優(yōu)勢，在于敏感性強(qiáng)，用于診斷地中海貧血，檢出率較高。另外，該方法同樣不同于傳統(tǒng)雜交法，可單次實(shí)現(xiàn)對(duì)多種突變進(jìn)行的檢測，便利性強(qiáng)。PCR-RDB診斷方法的缺陷，主要體現(xiàn)在存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)方面，易導(dǎo)致漏診[19]。臨床同樣發(fā)現(xiàn)，PCR-RDB僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)已知位點(diǎn)基因突變的診斷，如突變基因位于未知位點(diǎn)，則不建議采用該方法診斷。因此，為提高地中海貧血的檢出率，臨床仍需對(duì)此方法進(jìn)行謹(jǐn)慎選擇，降低漏診率，對(duì)患者的健康負(fù)責(zé)。

2.6 熒光定量PCR 熒光定量PCR，為PCR技術(shù)的一種，要求于體外環(huán)境下，對(duì)一對(duì)引物進(jìn)行催化。與PCR相同，該方法同樣可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的體外擴(kuò)增，從而供臨床判斷患者的DNA基因表達(dá)情況。地中海貧血患者，多伴有部分基因缺失，而大部分研究均發(fā)現(xiàn)，α-珠蛋白基因，為缺失基因的常見類型[20]。采用熒光定量PCR對(duì)疾病進(jìn)行診斷，有助于及早發(fā)現(xiàn)異常，從而及早采取措施控制病情，改善患者的健康狀況。 但該診斷方法，同樣存在缺陷。如選取的相對(duì)定量與標(biāo)準(zhǔn)曲線存在局限性，診斷結(jié)果可能出現(xiàn)誤差，增加漏診以及誤診發(fā)生的可能。

2.7 ASO ASO技術(shù)又稱探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)，該技術(shù)要求獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，后將其點(diǎn)于尼龍膜上，繼而對(duì)基因進(jìn)行區(qū)分，將其分為突變與正常兩種。臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用該技術(shù)診斷地中海貧血，能夠?qū)φＥc突變的ASO進(jìn)行鑒別，并使兩者雜交。探針不完全互補(bǔ)的情況下，如條件允許，具有完全洗脫的可能。此時(shí)，觀察雜交結(jié)果，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)地中海貧血的診斷。該診斷方法，優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在假陰性與假陽性均較低、特異性高方面。另外，采用ASO法診斷疾病，同樣具有靈敏度高、檢測便利性強(qiáng)以及檢查結(jié)果獲取速度快的優(yōu)勢，臨床可對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用。但該診斷方法，同樣具有一定的缺陷，具體體現(xiàn)在對(duì)DNA純度與數(shù)量要求高、存在放射性污染方面。每次雜交僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一種突變的檢測。地中海貧血中，β型具有異質(zhì)性高的特點(diǎn)，采用ASO法診斷時(shí)，需頻繁對(duì)探針進(jìn)行更換，方可確診疾病。

綜上所述，采用紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)、血紅蛋白組分分析等方法，對(duì)地中海貧血進(jìn)行篩查，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。但根據(jù)篩查方法的不同，其優(yōu)勢與缺陷同樣存在差異。臨床可根據(jù)醫(yī)院的條件，以及患者的需求，對(duì)不同篩查方法進(jìn)行選擇，及早發(fā)現(xiàn)地中海貧血的風(fēng)險(xiǎn)。單獨(dú)采用上述方法篩查，難以確診地中海貧血。因此，臨床還需在此基礎(chǔ)上，利用ARMS、PCR、PCR-SSCP等方法診斷，則可提高疾病檢出率。臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)各類診斷方法的點(diǎn)的重視，與此同時(shí)，將篩查與基因診斷法結(jié)合，全面提升地中海貧血的檢出率，為居民健康狀況的改善提供保證。此外，還需重點(diǎn)對(duì)廣東、廣西兩省孕婦進(jìn)行篩查，如發(fā)現(xiàn)胎兒存在罹患地中海貧血的風(fēng)險(xiǎn)，需考慮及早采取措施干預(yù)，或考慮引產(chǎn)，提升我國新生人口質(zhì)量。