毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3對膽管癌神經浸潤的影響

張宏偉，王彩茹，繆國東，張化玉，高福洋，劉海英

（承德市中心醫院，河北 承德 067000）

膽管癌是一類侵襲性腫瘤，惡性程度較高，病情具有隱匿性特征，該病診斷率低、病死率高。治療最有效的方法是手術切除，術后復發率較低，對放療與化療不敏感，預后情況較差。有醫學研究表示：膽管系統中的自主神經較為活躍，腹腔神經叢距離膽管惡性腫瘤較近，周圍神經叢容易受到腫瘤的侵襲，導致神經浸潤[1]。多次實踐研究得出：膽管癌經由膽管癌周圍神經遞質分泌誘發膽管癌神經浸潤所導致。周圍神經遞質主要依靠激活毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（ChRM3）而發揮的作用，會對膽管癌神經浸潤產生較強的抑制。本研究主要針對激動劑匹羅卡品、抗結劑阿托品對ChRM3的作用，研究膽管癌神經浸潤能力所受的影響，下面是研究報道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 篩選經外科手術切除的膽管病理組織標本90例展開研究，標本均用石蠟包埋，重新篩選腺癌組織標本60例，正產膽管組織標本30例。

1.2 方法

1.2.1 細胞系與所選試劑 膽管癌（RBE細胞系）從上海細胞庫購買，美國提供胎牛血清（FBS）、培養基RPIM1640、匹羅卡品，武漢昌恒生物醫藥制品研究所提供硫酸阿托品，青島市藥檢所動物實驗中心提供昆明種純系胚胎小鼠。

1.2.2 培養細胞 膽管癌細胞（RBE）系運用的培養液：胎牛血清RPMI1640（體積分數0.10），溫度處于37oC，運用CO2恒溫養箱體積分數0.05進行培養，定期更換培養液，等細胞融合80%-90%后，使用于含有2.5 g/L EDTA的胰酶消化，配置為細胞懸液，于培養瓶上接種，取出對數生長期的細胞使用胰酶2.5 g/L EDTA消化待用，每天采用顯微倒置觀察細胞的生長情況，在規定時間內將其拍照記錄。

1.2.3 構建體外膽管癌神經浸潤模型 將本研究小鼠 DRGRBE 細胞共培養模型培養液分為4組，甲組（僅加含血清培養基RPMI1640）、乙組（含有血清培養基RPMI1640＋匹羅卡品1 mmol/L）、丙組（含血清培養基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L＋匹羅卡品1 mmol/L）、丁組（含有血清培養基RPMI1640＋阿托品0.1 mmol/L）。取出RBE膽管癌細胞（對數期生長）候用，消化以2.5 g/L胰酶進行，離心后運用胎牛血清RPMI1640培養液處理RBE膽管癌細胞并計數，細胞密度調整在1.0×108個L待用。操作期間應選取整潔干凈的工作平臺，脫頸將小鼠處死，于顯微鏡下對小鼠的背根神經節進行修剪，然后將其放在生理鹽水中清洗。于孔板上各小孔放上1 cm×1 cm消毒蓋玻片預冷，于蓋玻片中央放置DRG，覆蓋50 μL Matrigel，在培養箱中放置6孔板，溫度保持在37oC，固化時間達30 min，將準備好的細胞懸液分別加入其中，覆蓋Matrigel和DRG ，選取培養箱（體積分數0.05）CO2培養，每隔4 h在顯微鏡下觀察神經纖維黏附狀況、RBE細胞，詳細記錄細胞變化。36 h后選取中性甲醛溶液（40 g/L）將其固定，利用Nissl染色后運用顯微鏡觀察，計數采用高倍鏡，將高倍鏡調節為5進行細胞計數，計算平均數值。

1.3 觀察指標 觀察DRG-RBE細胞共培養模型培養36 h后添加不同試劑的浸潤細胞數目。

2 結果

在DRG-RBE細胞共培養模型培養36 h后，浸潤細胞數目為18.0±0.71；添加匹羅卡品后，浸潤細胞數目31.60±0.93，差異顯著（P＜0.05）；添加匹羅卡品拮抗劑阿托品后，浸潤細胞數目為20.0±0.71，單獨添加阿托品后，浸潤細胞數目為20.20±0.86，差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

本研究加入匹羅卡品、阿托品后，ChRM3激動劑匹羅卡品能夠明顯增強RBE細胞浸潤能力，阿托品可以削弱匹羅卡品產生的促浸潤作用[2]。阿托可結合匹羅卡品ChRM3，實現對匹羅卡品的抗擊，阿托品從原則上來說無法與ChRM3結合，效果的發揮存在難度，若單獨應用阿托品，難以制約RBE細胞的神經浸潤。

總體來說，匹羅卡品能夠增強膽管癌細胞的神經浸潤功能，阿托品會削弱匹羅卡品浸潤能力，可改善ChRM3的活性，可以為抑制膽管癌的神經浸潤提供新的治療靶點。