泡沫細胞ABCA1和microRNA-33基因表達機制的探討

劉燕銀，陳玉甜，陳立強

（1.廣州市南沙區東涌醫院，廣東 廣州 511453；2.肇慶醫學高等專科學校，廣東 肇慶 526060）

動脈粥樣硬化是一種由于炎癥反應引起膽固醇在單核細胞內聚積而形成泡沫細胞，泡沫細胞粘附于動脈內壁而形成動脈斑塊及血管硬化的疾病，現在對膽固醇的在單核巨噬細胞內積累還待深入研究[1]。泡沫細胞內膽固醇流出需要特定的轉運蛋白參與有研究顯示ABC轉運體在膽固醇流出過程中發揮著重要作用，但是具體機制仍不清楚；近年研究亦發現microRNA在不同的疾病的發病過程中發揮重要作用，包括冠心病。microRNAs是21-23 nt組成的非編碼RNAs，其與mRNA3’-未翻譯結構域序列互補結合并導致該mRNA的翻譯受抑制[2]。本研究通過觀察ABCA1和microRNA-33基因在THP-1細胞、巨噬細胞與泡沫細胞中的表達變化，旨在初步探討ABCA1和microRNA-33基因在膽固醇流出的作用，為進一步探討動脈粥樣硬化形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 THP-1細胞購于中科院上海細胞庫，逆轉錄PCR試劑盒購于大連寶生物公司，PCR引物由上海生物工程公司合成，miRNA qRT-PCR檢測試劑盒購于GeneCopoeia公司、Trizol購于life公司、qRT-PCR自動分析儀9700購于ABI公司等。

1.2 細胞培養和分組 THP-1細胞用含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37oC，5%CO2培養箱中培養，取對數生長期的THP-1懸浮細胞接種于六孔細胞培養板，每孔加160nmol/L佛波酯誘導細胞貼壁，培養24 h，使其分化成為巨噬細胞；培養24 h后更換含0.1%牛血清白蛋白的RPMI-1640培養基，同時加入50 μg/mL的乙酰化低密度脂蛋白，培養24 h，誘導其成為泡沫細胞。

1.3 方法

1.3.1 抽提THP-1細胞總RNA 取 TRIzol 處理好的勻漿THP-1細胞，室溫靜置；加入0.2 mL氯仿，劇烈震動15 s，室溫靜置2 min；12000×g 4oC離心15 min，移上層水相至新EP管，加0.5 mL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min；4oC 12000×g離心10 min 棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀，4oC 7500×g離心5 min；棄上清空氣中干燥；20 μL無RNA酶水溶解總RNA，60oC孵育10 min。紫外分光光度儀檢測提取的總RNA 濃度，-80oC保存。

1.3.2 測定ABCA1基因RNA含量 根據ABCA1基因在文獻服務檢索系統（Pubmed）中查到的GenBank序列，按照引物設計原則設計引物，引物交由上海生物工程公司合成，ABCA1基因上游引物5’-CAGGAGGTGATGTTTCTGACCA-3’；下游引物5’-TTGGCTGTTCTCCATGAAGGTC-3’，產物長度449 bp；β-actin上游引物5’-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3’下游引物5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’，產物長度538 bp。以提取的RNA為模板，反應條件為50oC 30 min，94oC 2 min，94oC 30 s，58oC 30 s，68oC 40 s，35個循環。RT-PCR反應完成后取3 μL RT-PCR產物，在1%瓊脂糖凝膠中于80 V恒壓電泳30 min，紫外透射儀觀察并拍照。圖片經圖像分析軟件Band Scan進行光密度值掃描分析，計算各泳道ABCA1與內參照β-actin光密度之比作為ABCA1相對含量值。

1.3.3 熒光定量PCR 利用miRNA qRT-PCR檢測試劑盒逆轉錄1 μg總RNA，按照GeneCopoeia公司說明書對microRNA特異性引物和接頭引物進行PCR反應，用U6作為內源性參照基因，檢測microRNA-33的表達水平。

1.4 統計學分析 采用統計學軟件SPSS 15.0統計軟件進行分析，計量資料采用Mean±SD表示，正態分布資料用單因素方差分析比較多組間差異，用t檢驗比較兩組間的差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THP-1細胞、巨噬細胞和泡沫細胞中ABCA1基因mRNA表達 與對照組的THP-1細胞比較，巨噬細胞組ABCA1基因表達水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細胞組ABCA1基因表達水平明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。THP-1細胞、巨噬細胞和泡沫細胞中ABCA1基因 mRNA表達分別為（0.329±0.025）、（0.336±0.023）和（0.537±0.046），見圖1。

2.2 microRNA-33檢測結果 如圖2所示，與對照組的THP-1細胞比較，巨噬細胞組microRNA-33基因表達水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細胞組microRNA-33基因表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

ABCA1轉運體通過利用ATP幫助底物進行跨膜轉運，而在避免單核細胞泡沫化中ABCA1轉運體發揮著重要作用。膽固醇在單核細胞內聚集使其泡沫化，泡沫細胞沉積于動脈內皮造成血管硬化、炎癥效應和發展為動脈粥樣硬化，研究表明microRNA-33與其作用基因（SREBF2和SREBF1）共同表達，協同表達轉錄因子參與膽固醇和脂肪酸的合成與吸收[3]。因此，膽固醇流出并分解代謝是預防動脈粥樣硬化的一個很重要的因素，膽固醇轉運需多種調節因子相互配合，包括ABC轉運體家族、清道夫受體家族、膽固醇調節蛋白和肝X受體等[4]。研究顯示對ABCA1轉運蛋白進行基因敲除，可造成泡沫細胞膽固醇流出功能障礙而引起膽固醇積累和炎癥的發生，microRNA-33通過抑制SREBF2和SREBF1基因以及下游的細胞信號通路的表達，從而對參與膽固醇流出的基因進行調控，包括ABCA1、ABCG1、NPC1和FAO（HADHB、CROT、CPT1A、PRKAA1）等基因[5-6]。

本研究通過利用人急性單核細胞白血病細胞系-1（THP-1）源性泡沫細胞為研究對象，觀察細胞內ABCA1和microRNA-33基因表達情況。課題組利用泡沫細胞模型，采用半定量RT-PCR檢測THP-1細胞、巨噬細胞與泡沫細胞ABCA1和microRNA-33基因表達水平變化，結果顯示與對照組的THP-1細胞比較，巨噬細胞組ABCA1基因表達水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細胞組ABCA1和microRNA-33基因表達水平有明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）；因此膽固醇逆向轉運需ABCA1基因參與，ABCA1介導泡沫細胞膽固醇流出，而microRNA-33基因與ABCA1基因表達呈負相關，本研究結果為動脈粥樣硬化的形成提供了新的理論依據。