烏海地區銅綠假單胞菌耐藥基因研究分析

孫金蓮，孫桂苓，王院，孫建雯

（烏海市人民醫院檢驗科，內蒙古 烏海 016000）

PDRPA是引起呼吸道感染也是臨床上分離率較高、其致病性強耐藥率高，是引起臨床感染的常見的主要病原菌之一，該菌感染造成多重耐藥性是院感科監測的重點[1]。其多重耐藥性與其產生生物膜、膜孔蛋白形成及多種耐藥基因產生有密切關系[2]，由于β2內酰胺類抗生素的廣泛使用和碳青酶烯酶的產生及細胞膜通透性降低造成抗菌藥物失活。該菌感染主要發生在ICU、呼吸內科和神經外科分離率明顯增高，近幾年對多種抗菌藥物的耐藥性呈明顯上升趨勢，經抗菌藥物合理使用和正確干預耐藥性均有所下降。

1 材料與方法

1.1 標本來源 采取2018年1月-2019年12月引起我院門診及住院患者感染送檢的各種標本培養共分離出該菌62株，標本主要為痰液、傷口分泌物、尿、無菌體液、支氣管灌洗液，血液嚴格采集非同一患者不同部位分離到的菌株。

1.2 菌株分離與鑒定 PCR擴增儀（Eppendorf公司）；凝膠成像分析系統（北京六一WD-9413B）；PCR擴增試劑盒、核酸染料Mastermix（貨號pc1120）、細菌基因DNA提取試劑盒（貨號D1600）、TAE緩沖液（貨號T1060）均購自北京華大基因生物技術有限公司。

1.3 細菌總DNA提取片段 組成分別為：2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp本品已含有1×loadingBuffer的DNA溶液，提取的DNA可取8 μL直接電泳。

1.4 PCR擴增基因引物設計 參照文獻，由北京華大基因生物技術有限公司合成目的基因片段。β-內酰胺酶：TEM-P1：CTGAATGAAGCCATACCAAA；P2：TGTAGATAACTACGATACGGGAG。VEB-P1：GCGGTAATTTAACCAGA；P2: GCCTATGAGCCAGTGTT。CRAB-P1：AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC；P2：TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC。OXA-10P1：AATGGTGTTTTCGTGCTTT；P2：TTCTTACTTCGCCAACTTCT。金屬β-內酰胺酶： IMP-P1：CGGCCTCAGGAGAGGCTTT；P2:AACCAGTTTTGCCTTACTAT。VIM-P1：TCCGACAGTCAGCGAAT；P2 :GCAGCACCAGGATAGAAGA。DHA P1：AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT；405P2：CCGTACGCATACTGGCTTTGC。氨基糖苷類修飾酶：aac（6＇）-Ib P1：ATGACTGAGCATGACCTTGC；P2：TTAGGCATCACTGCGTGTTC。aac（6＇）-II P1：TTCATGTCCGCGAGCACCCC；P2：GACTCTTCCGCCATCGCTCT。ant（2＇）-I P1：GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG；P2：CTGTTACAACGGACTGGCCGC。qacE△1-sul1P1：TA GCGA GGGCTTTACTAA GC；P2：CTGAATGAAGCCATACCAAA。膜孔蛋白：OprD2 P1：TGTAGATAACTACGATACGGGAG；P2：GCGGTAATTTAACCAGA。SHV P1：GGTTATGCGTTATATTCGCC786；P2：TCCCGCAGATAAATCACCA。PER P1：AGTCAGCGGCTTAGATA 978；P2：CGTATGAAAAGGACAATC。為避免非特異性擴增，反應體系需在冰上配置；反應開始前預熱PCR儀至95oC，將反應體系充分混勻離心后置于PCR儀上開啟反應體系：98oC預變性5 min、變性15 s，55oC退火30 s 75oC延伸1 min，反應1個循環，75oC補充延伸5-10 min。

2 結果

2.1 共分離該菌62株（剔除同一患者重復菌株） 關于B2內酰胺類抗菌藥物耐藥相關基因檢測結果顯示分別為：TEM 68.8%、OprD2 21.9%、VIM 15.3%、IMP 9.4%、SHV 9.4%和DHA 6.3%，未檢出OXA、PER及CRAB基因。

2.2 氨基糖苷類修飾酶基因檢測結果 62株該菌檢出氨基糖苷類修飾酶（AMEs）基因檢出率為56.9%。各基因檢出率從高到低分別為aac（6＇）-Ib為23.3%、aac（6＇）-II為19.4%、ant（2＇）-I為14.2%。

2.3 消毒劑與磺胺類和氟喹諾酮類耐藥基因檢測結果 62株該菌檢出qacE$2sul1耐藥基因檢出率為28.1%，氟喹諾酮類耐藥基因qnr陰性。

3 討論

該菌屬非發酵菌屬在自然界分布廣泛，醫院對該菌的分離率較高，全院致病菌排名前五位。該菌是引起醫院感染的重要病原菌，在治療中不斷產生多藥耐藥性與臨床大量使用高級抗生素有關[3]。其主要耐藥機制是膜孔蛋白結構和功能改變、質粒及染色體的變異、易產生抗生素降解酶、修飾酶、生物膜的形成等[4]，該菌感染造成臨床治療困難。PCR結果顯示氨基糖苷類修飾酶、TEM型β2內酰胺酶、qacE△1-sul1、VIM型金屬β2內酰胺酶等基因擴增陽性，oprD2基因擴增檢測呈缺失型造成相應類別抗生素耐藥[5]。尤其對碳氫酶希類、β-內酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類等抗生素均高度耐藥，對喹諾酮類耐藥率較低。質粒中含有大量金屬β2內酰胺酶基因造成廣泛傳播,質粒可以同時攜帶多種滅活藥物的修飾酶形成多重耐藥機制。同時臨床的不規范抗生素使用加快了耐藥的出現降低了治療效果，對ICU重度感染的患者采取降階梯聯合治療可以提高抗感染效果。隨著抗生素的廣泛使用耐藥性上升已成為臨床抗感染的嚴峻課題。因此加強細菌耐藥監測為臨床提供科學依據，控制多重耐藥菌的產生有著十分重要意義。醫院應嚴格控制高級別抗生素的用藥指征，應動態監測送檢標本依據藥敏結果正確選擇抗菌藥物減少耐藥菌株的產生。同時院感科應不斷加強多重耐藥菌的控制，切斷感染源和傳播途徑采取有效措施防止院感爆發流行。