黃芪甲苷免疫親和色譜介質的制備及應用

黃陳 于生蘭 徐加兵

摘要：旨在提出1種新的具有高靈敏度、特異性抗黃芪甲苷（AST）單克隆抗體的純化方法，從而為制備具有類似活性基團的其他天然化合物的親和層析樹脂方法提供參考。用AST與環氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）偶聯制備的免疫親和柱從小鼠腹水中純化抗AST的高敏單克隆抗體（mAbs），與用G-葡聚糖凝膠從小鼠腹水中純化的抗AST單克隆抗體進行比較，通過間接ELISA（酶聯免疫吸附測定）和間接競爭ELISA比較2種方法純化的單克隆抗體，評價親和培養基的效用。間接ELISA結果顯示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價略高于用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗體效價;間接競爭ELISA結果顯示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的結合抑制50%濃度（IC50）為 0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的IC50為0.05 μg/mL，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體比用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體對AST更具有特異性。

關鍵詞：親和色譜層析介質;黃芪甲苷;環氧活化瓊脂糖凝膠6B;ELISA;SDS-PAGE

中圖分類號： O657.7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0218-04

目前純化抗體的方法主要包括不同組合的G蛋白純化、離子交換法和排阻色譜技術等[1]。然而，這些方法有時不能有效分離出某些特異性抗體[2]。因此，使用這些非特異性純化方法分離的抗體還不能完全滿足許多研究應用的要求[3]。免疫親和色譜（IAC）是一種液相色譜，其中固定相由抗體或抗原試劑組成，該技術代表親和色譜的一個特殊亞類，其中的生物相關結合劑用于選擇性純化或分析目標化合物[4]。由于抗體與它們各自的靶標能夠選擇性和特異性結合，這使它們作為親和色譜中的固定配體多年來倍受關注。IAC使用的主要方法是利用固定化靶標進行抗體純化[5]。

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，簡稱AST）是中藥黃芪藥理活性的主要物質之一，為黃芪及其制劑質量鑒定的指標成分。藥理研究結果表明，AST具有調節機體免疫力、保護組織器官、降低血糖、抗細胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常廣闊的發展前景[6]。本研究以黃芪甲苷為配體，采用環氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）親和色譜法，從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體。用間接酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）和間接競爭ELISA對用AST-EAS6B純化的抗體與用G-葡聚糖親和色譜純化的抗體的效價和特異性進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

AST標準品，成都曼特生物技術有限公司（成都）;3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）底物緩沖液，北京索萊寶科技有限公司（北京）;辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG+[免疫球蛋白（IgG）二抗]，武漢博斯特生物科技有限公司（武漢）;環氧活化瓊脂糖6B，購自Sigma-Aldrich（圣路易斯，美國）;本研究所用其他化學藥品均購自中國藥品化學試劑有限公司（北京）。

AST-卵清蛋白（AST-OVA）和含有抗AST單克隆抗體的小鼠腹水，由筆者所在實驗室制備，前期筆者所在研究團隊對黃芪甲苷人工抗原的合成與評價進行了研究[7]。

1.2 方法

1.2.1 親和介質的制備（AST-EAS6B） AST在固體載體上的共價偶聯是根據制造商對環氧活化的瓊脂糖凝膠6B（Sigma-Aldrich）和相關文獻的說明進行的。方法如下：將0.2 g EAS6B懸浮在 50 mL 蒸餾水中，在溶脹后（1 g凍干粉末約產生 3.5 mL 最終體積的介質），用200 mL蒸餾水洗滌介質1 h;將10 mg AST溶于5.1 mL甲醇（體積分數為80%，pH值為11.0）中，將含有AST的溶液與介質在塞式容器中混合，并在40 ℃下于水浴中振搖 16 h，過量AST用甲醇（體積分數為80%）洗滌。然后將培養基轉移至1 mol/L乙醇胺（pH值為8）中，于50 ℃過夜。最后，用 1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8，含有 0.5 mol/L NaCl）徹底沖洗產品3次。空白介質（指未用AST耦合的環氧活化瓊脂糖凝膠6B介質）的具體制備方法如下：將0.2 g EAS6B懸浮在50mL蒸餾水中，溶脹后（1 g凍干粉末產生約3.5 mL最終體積的介質）用200 mL蒸餾水洗滌介質1 h;然后將培養基轉移至1 mol/L乙醇胺（pH值為8）中，于50 ℃過夜;最后用1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8，含有0.5 mol/L NaCl）徹底沖洗產品3次。

1.2.2 抗AST單克隆抗體的純化 為了用AST-EAS6B純化抗AST抗體，本試驗制備了免疫親和色譜柱，從含抗AST單抗的5 mL小鼠腹水中純化了活性抗AST單抗。將AST-EAS6B介質裝入1個普通的固相萃取柱中，上部、下部裝上篩板。對固相萃取流出液進行收集，并利用紫外分光光度計（Huxi HD-21-2）進行分析。用偶聯緩沖液洗滌柱子，直到流出液在280 nm處的吸光度為0。然后，用10倍柱體積的純化水沖洗，并用10倍柱體積的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4/Na2HPO4，pH值為7.0）平衡。用20 mL平衡緩沖液稀釋含抗AST單抗的小鼠腹水（5 mL），以0.3 mL/min的流速裝入柱中。樣品裝入后，用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，然后用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸緩沖液，pH值為2.7）洗脫mAb（單克隆抗體，指AST單抗），直到流出液在280 nm處的吸光度為0，洗脫的抗體立即用Tris堿中和。用G-葡聚糖凝膠純化單克隆抗體時，將G-葡聚糖凝膠裝入固相萃取柱中，上部、下部裝上篩板，后續方法與上述用AST-EAS6B純化抗AST抗體的方法相同。為了比較，使用“1.2.1”節的空白介質制備的柱純化5 mL小鼠腹水作為對照。純化后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，10%丙烯酰胺）分離，用考馬斯亮藍（CBB）染色，用微量蛋白UV定量儀測定純化的單克隆抗體濃度[8-9]。

1.2.3 間接ELISA和間接競爭ELISA檢測抗AST單克隆抗體 用間接ELISA檢測時，將AST-OVA用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH值為9.6）溶解成濃度為1.25 μg/mL，包裹在96孔微量滴定板（美國康寧公司）上，于4 ℃孵育過夜;用含0.05%吐溫20的磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗3次，再用1%（m/V）脫脂奶粉在37 ℃磷酸鹽緩沖液中封閉1 h，封閉非特異性蛋白結合位點。將純化的單克隆抗體、陰性對照組（生理鹽水）和空白對照組（用相同方法純化的無單克隆抗體的正常小鼠腹水）在磷酸鹽緩沖液中稀釋至1 ∶ 1 000～1 ∶ 50 000，每孔加入100 μL，1式3份。將微孔滴板在37 ℃下孵育60 min，用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌，在每個孔中加入1 ∶ 5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG+。將平板在37 ℃下孵育1 h，洗凈，加入TMB基質溶液（含0.2 mg/mL TMB，將50 μL 30% H2O2溶解在10 mL 0.1 mol/L檸檬酸鹽-0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH值為 5.2），將平板在室溫下孵育30 min，用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，使用BioTek ELx800 ELISA閱讀器在450 nm波長下測量吸光度[10]，試驗1式3份，以平均值作為最終值。用間接競爭ELISA（idcELISA）方法檢測純化的抗AST單克隆抗體的特異性時，以50 μL連續稀釋的AST為競爭物，與50 μL最佳稀釋的純化抗AST單克隆抗體一同加入微孔中，1式2份。在陽性對照孔中，抗AST單克隆抗體沒有添加任何競爭物AST，其他步驟與間接ELISA所描述的步驟相同。

2 結果與分析

在抗AST單克隆抗體的純化步驟中，從加入 5 mL 小鼠腹水開始，將純化的mAb冷凍干燥、稱質量。結果表明，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體為2.9 mg，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體為3.5 mg。用磷酸緩沖鹽溶液將2種方法純化的mAb稀釋到1 mg/mL的濃度，用間接ELISA法檢測抗AST抗體的效價，用間接競爭ELISA法測定抗AST抗體的敏感度。如表1、圖1所示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價大于25 600，而用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的效價約為18 000。由圖2可以看出，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價略高于用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗體效價。間接競爭ELISA結果（表2、圖2）顯示，用 AST-EAS6B 柱純化的抗AST單克隆抗體的結合抑制50%濃度（IC50）為0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的IC50為 0.05 μg/mL。間接ELISA、間接競爭ELISA檢測結果表明，陰性對照的D450 nm顯著低于抗AST單克隆抗體的D450 nm（P<0.05）。最終值采用3個重復的平均值±標準偏差。以上結果表明，用AST-EAS6B純化的抗AST單克隆抗體比用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體對AST更具有特異性。

3 討論

在筆者之前的研究中，從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體是用一些非特異性的方法，如蛋白G的不同組合、離子交換和排阻色譜技術。這些用非特異性方法純化的單克隆抗體對于現實的研究和應用來說不夠靈敏，而且純化耗時較長。當有足夠量的抗原被固定時，能夠提供較強的結合力，基于固定抗原的親和層析技術是非常有效的[11]。在本研究中，1 mL ESA6B約耦合1.35 mg AST，并且高的耦合速率確保了AST-EAS6B柱的強結合能力。當用AST與環氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）偶聯制備的免疫親和柱制備完成后，用該方法從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體能夠獲得高效價、高特異性的抗體。純化抗AST單克隆抗體的結果表明，固定化AST親和色譜可以選擇性地捕獲與AST特異結合的蛋白質，能夠有效地完成變性抗體的排除和活性抗體的特異性捕獲。本研究結果為進一步研究高靈敏度、高效價的抗AST單克隆抗體奠定了基礎，如ELISA檢測AST的定量檢測方法的建立。此外，基于其選擇性捕獲與AST結合的蛋白的能力，固定化AST親和層析可用于鑒定不同組織中的AST靶點[12]。本研究還提供了1種制備具有類似活性基團的其他天然化合物的親和層析樹脂的方法。

參考文獻：

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