基于不同激素組合的紫丁香成熟種子組培誘導研究

王愛芝 王清君 劉運偉 沈海龍

摘要：? 以紫丁香成熟種子為外植體，采用不同激素組合培養基進行組培誘導試驗的結果表明：采用中間切割方式的種子萌發率較高，最高可達59.72%;NAA與BA組合誘導丁香種子效果較好，NAA0.1 mg/L+BA1.0 mg/L的誘導率可達88.89%，MS+BA3.0 mg/L為頂芽和帶芽莖段的最適增殖繼代培養基;莖芽在試管內、外生根時間分別為20天和4～? ? 6周，生根率均為100%，紫丁香成熟種子組織培養試驗取得成功。

關鍵詞：? 紫丁香;? 成熟種子;? 生長激素;? 組織培養

中圖分類號：? ?S 685. 26， S 723. 1 + 32. 6? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2020）01 - 0001 - 05

紫丁香（Syringa oblata），木犀科丁香屬，落葉灌木或小喬木，樹高可達4～5 m，花期為4～5月，花冠紫色，蒴果扁形[ 1 - 2 ]。紫丁香具有花繁、葉茂、香濃、適應性強的特點，特別耐寒、耐旱，亦稍耐蔭，是一種優良的觀花樹種，也是一種良好的蜜源植物[ 3 - 5 ]，具有很高的景觀價值、經濟價值和生態價值。紫丁香有多種繁殖方法，包括播種、扦插、嫁接、分株、壓條、組培等，其中，組織培養技術在丁香繁殖中廣泛采用[ 6 - 22 ]。當前，丁香屬植物組培研究的外植體材料主要采用根尖、莖段、莖尖、休眠芽、幼葉、葉柄、幼花序軸等，但以種子作為外植體的研究尚未見報道。本研究利用紫丁香成熟種子為外植體，利用離體擴繁的手段，實現了紫丁香樹木改良，為進一步優化丁香屬育苗方式、完善丁香屬良種快繁技術體系提供理論依據，進而推動丁香屬良種快繁產業化發展。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料采用紫丁香成熟種子，采自位于哈爾濱市的東北林業大學（地理坐標：126°63′E，45°72′N）校園逸夫實驗樓對面，文管樓東側1株20年生紫丁香樹。該樹生長狀況良好，其花色與校園內其它紫丁香樹相比，花色更為純正。2018年10月種子成熟時，從樹冠上部、中部、下部隨機采集成熟紫丁香蒴果，搓掉果皮，去掉干秕粒，將600粒干凈種子裝入塑料夾鏈袋，封口存放于實驗室4 ℃冰箱中，供試驗使用。試驗試劑為H2O2溶液、吐溫20、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、細胞分裂素BA、蔗糖、瓊脂等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 種子質量檢驗

發芽率是檢驗種子播種品質重要指標，為保證試驗所用的紫丁香成熟種子質量，首先對種子進行發芽率檢驗。2019年3月，隨機取90粒種子，用清水浸泡3天，取3個培養皿，皿中均勻平鋪薄層脫脂棉，剪與培養皿等大的圓形吸水紙，平鋪在脫脂棉上。將泡好的種子均勻擺放在吸水紙上，每個培養皿隨機放30粒種子，3次重復。種子用蒸餾水潤濕后，將培養皿放入培養箱內。培養條件為：光照16 h/黑暗8 h，光強2 000～3 000 lx，溫度25±2 ℃，濕度70%～80%。每天觀察發芽情況，計算種子發芽率。

1. 2. 2 種子初代誘導培養

初代誘導培養基采用MS基本培養基，激素采用生長素NAA，IBA和細胞分裂素BA。NAA，IBA均采用0，0.1，0.5，1.0 mg/L 4個濃度水平，BA采用0，1.0，3.0，5.0 mg/L 4個濃度水平，添加蔗糖20 g/L、瓊脂6 g/L，使pH=5.8。從冰箱中取出紫丁香種子，清水浸泡3天后接種。接種前，用75 %酒精表面滅菌30～60 s，然后在10 %的H2O2溶液中滴加2～? 3滴吐溫20，攪拌消毒10 min，然后在超凈工作臺下用無菌水沖洗干凈。接種采用完整種子、兩端切和中間切3種切割方式，每種方式接種100粒，水平接種于成熟種子的初代誘導培養基上，調查不同切割方式下的種子萌發時間、萌發率及生長情況，選擇最優切割方式，做初代誘導培養試驗，確定最適激素組合。

1. 2. 3 種子繼代增殖培養

繼代增殖培養基采用MS基本培養基，激素采用NAA和BA。NAA采用0和0.1 mg/L 2個濃度水平，BA采用1.0和3.0 mg/L 2個濃度水平，添加蔗糖20 g/L，瓊脂7 g/L，使pH=5.8。取初代培養誘導得到的無根莖芽，剪取其頂芽和1 cm長的莖段，分別以垂直和水平的方式，接種于繼代增殖培養基上，每個處理接種20個外植體。調查不同激素組合下成熟種子不定芽誘導率、增殖系數和生長情況，以及頂芽和帶芽莖段的培養生長情況，選擇繼代增殖培養最適激素組合。

1. 2. 4 莖芽生根調查

生根率試驗分為試管內、外生根2項試驗，每項試驗分別處理200個無根莖芽。（1）試管內生根。本試驗的生根培養基采用1/2MS+IBA 1.0 mg/L +2%蔗糖+0.6 %瓊脂，使pH=5.8。將增殖培養得到的紫丁香莖芽（高2 cm以上）切下，垂直轉接于生根培養基上培養。（2）試管外生根。將紫丁香組培莖芽（高2～5 cm）扦插到純草炭：珍珠巖=1：1的基質中，葉面噴水，在組培苗馴化室內培養。分別調查試管內、外生根時間和生根率。

2 結果與分析

2. 1 種子質量檢驗

按照試驗設計進行發芽率試驗，觀測1周后，發現種子表面有發霉現象，用75 %的酒精擦洗種皮，換床培養。經觀察，發芽試驗開始后的第5天，第1粒種子發芽，之后每天均有種子發芽。通過整理發芽試驗記錄表，得到種子發芽試驗結果。3組重復的種子發芽率分別為90.00%，93.33%和86.67%，平均發芽率達到90%，可見試驗所用種子質量較好，可以進行下一步試驗。

2. 2 不同切割方式對種子萌發的影響

本試驗采用完整種子、兩端切和中間切3種切割方式進行水平接種，由不同切割方式下的種子萌發及生長情況（表1）可以看出，切割方式對種子萌發影響較大。完整種子自接種后3周內，除了種皮膨脹外無其它變化，3周后才開始發芽;兩端切割的種子2周后就可萌發，中間切割的種子也是2周開始萌發，但萌發率更高，且長出了綠色子葉，長勢良好。從種子最終萌發率可以看出，中間切割的種子萌發率最高，達到59.72%;兩端切割的種子萌發率最低，只有43.94%;完整種子介于兩者之間，但更接近于兩端切割的種子。

表1 不同切割方式下的種子萌發及生長情況

2. 3 不同激素組合對種子初代誘導的影響

2. 3. 1 不同激素組合對不定芽誘導率的影響

由NAA和BA組合對紫丁香成熟種子不定芽誘導率的影響（表2）可以看出，當培養基中不添加NAA時，BA濃度在0～3.0 mg/L，二者組合僅有50 %的種子誘導出不定芽;當BA濃度達到5.0 mg/L時，不定芽誘導率達83.33 %。NAA濃度為0.1 mg/L時，紫丁香種子不定芽的平均誘導率最高，為71.43 %。當NAA濃度為1 mg/L時，BA濃度為0時，不定芽的誘導率最高，出芽率達到了100 %。

由IBA和BA組合下的種子不定芽誘導率（表3）可以看出，IBA0.5 mg/L+BA3.0 g/L時，種子不定芽誘導率最高，為66.67 %。與NAA和BA組合相比，IBA和BA組合的初代培養基對紫丁香種子不定芽的誘導率效果較差。

表2? ?NAA和BA組合下的種子不定芽誘導率%

表3 IBA和BA組合下的種子不定芽誘導率%

2. 3. 2 不同激素組合對種子初代增殖及生長情況的影響

培養基內激素組合對紫丁香不定芽誘導的影響不僅表現在種子誘導率上，而且還表現在增殖系數及誘導出的不定芽本身的生長狀態上。由NAA，IBA和BA組合下的種子初代增殖及生長情況（表4，表5）可以看出，添加了NAA與BA組合的初代誘導培養基誘導不定芽的效果優于IBA與BA組合，NAA與BA組合誘導紫丁香種子不定芽的增殖系數則不如IBA與BA組合，甚至當IBA0.1 mg/L +BA5.0 mg/L時，一個種子最多可增殖7個芽。但從整體情況來看，添加了IBA和BA組合的培養基誘導出的不定芽生長情況不良，部分葉片卷曲，子葉枯黃。綜上可知，紫丁香種子不定芽誘導最適激素組合為NAA0.1 mg/L+BA1.0 mg/L，平均增殖系數為2.5。

2. 4 不同激素組合對繼代增殖培養的影響

2. 4. 1 頂芽外植體繼代增殖培養

在繼代增殖培養階段，將初代誘導產生不定芽的頂芽垂直接種在繼代培養基上。由頂芽繼代增殖培養生長情況（表6）可以看出，在繼代培養基上的紫丁香頂芽基部均可產生塊狀愈傷組織，甚至包圍整個外植體，愈傷組織主要表現為綠色、疏松，當激素濃度高時，變得致密。誘導出的不定芽的高度可達2～4 cm，經過繼代增殖培養，一個芽最多可增殖5個芽。

2. 4. 2 莖段外植體繼代增殖培養

在繼代增殖培養階段，將初代誘導產生不定芽的帶芽莖段（長1 cm）水平接種在繼代培養基上。由莖段繼代增殖培養生長情況（表7）可以看出，在繼代培養基上的紫丁香莖段基部均產生塊狀愈傷組織，甚至包圍外植體，誘導的愈傷組織多數出現黃化，當激素濃度高時，葉片與培養基接觸部位也誘導出愈傷組織，且愈傷組織變得更加致密;誘導出的不定芽最高為2 cm，經過繼代增殖培養，一個芽最多可增殖3個芽，隨著激素濃度的增加誘導出的不定芽出現輕微的玻璃化現象。綜合不定芽的生長狀態和增殖系數可知，對于頂芽和莖段繼代培養而言，最佳的增殖培養基均為MS+BA3.0 mg/L，增值系數可達到5。

表7 莖段繼代增殖培養生長情況

2. 5 紫丁香組培莖芽生根

丁香屬樹種在試管內生根相對容易，生根率很高。在本試驗中，組培10 天后莖芽開始生根;20 天后，每個莖芽長出3～6條具有須根的發達根系，生根率達100 %，最長根長約2 cm，平均根長1 cm。由于試管苗通常在無菌、恒溫、弱光的培養條件下生長發育，幼苗移栽后由異養轉入自養，對外界環境條件需要經過一段逐漸馴化的適應過程。所以，一般來說組培莖芽試管外生根前要進行煉苗。但是紫丁香經增殖培養或壯苗培養后的小苗長得較為健壯，木質化程度較高，因此，一直以來有關壯苗培養基和移栽前的預處理還沒有建立系統技術。在試管外生根方面，扦插4～6周后100%生根，紫丁香在增殖過程中部分莖芽基部會生根，數量不多，但較為粗壯發達。扦插時可不用去根，扦插時是否去根對其成活沒有顯著影響。由于紫丁香莖芽本身木質化程度高，葉片較厚，不易腐爛，所以紫丁香試管外生根對水分要求不嚴格，只需保持基質濕潤即可（含水率50%～70%）。扦插期間，根據基質情況，每天進行葉面噴水或澆水以保持基質濕潤，逐漸通風透光即可成苗。

3 結論與討論

本研究篩選質量較好的紫丁香成熟種子作為外植體，以不同切割方式和不同激素組合進行了組培試驗，研究結果表明，與完整種子和兩端切相比，中間切割的種子萌發率更高，達到了59.72%。NAA與BA組合誘導紫丁香種子不定芽效果優于IBA與BA組合，最佳激素組合為NAA0.1 mg/L+? BA1.0 mg/L，最高誘導率達88.89 %。平均增殖系數達2.5。經過初代誘導產生的不定芽，以頂芽和莖段為外植體接種在繼代培養基上，在不同激素組合下，生長狀態和增殖系數均有所不同，而最佳增殖繼代培養激素為BA3.0 mg/L。培養出的莖芽經過試管內、外生根試驗，其生根率均可達到100%，紫丁香成熟種子組培快繁試驗取得成功，該項技術可作為丁香屬良種快繁技術進行熟化和推廣。

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第1作者簡介：? 王愛芝（1975-），? 女，? 博士，? 助理研究員，? 主要從事種苗培育原理與技術的研究工作。

通訊作者：? 沈海龍（1962-），? 男，? 博士，? 教授，? 博士生導師，? 主要從事森林培育學的教學和科研工作。

收稿日期： 2019 - 11 - 28

（責任編輯：? ?王 巖）

Study on Tissue Culture Induction of Syringa oblata Mature

Seeds Base on Different Hormone Treatments

WANG Aizhi

（Yichun Academy of Forestry Science，? Heilongjiang Yichun 153000）

Abstract Using Syringa oblata mature seeds as explants， different hormone combination media were used for tissue culture induction experiments.The results showed that the germination rate of seeds was highest with intermediate cutting method （up to 59.72%）. The highest induction rate was 88.89% with the combination of 0.1 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA. The optimum culture medium for terminal bud and stem with buds was MS + BA 3.0 mg/L. The rooting time of shoot was 20 days in vitro and 4-6 weeks ex vitro， respectively， with 100% of the rooting rate. Our results suggested that the tissue culture of S. oblata was successful using mature seed as explants.

Key words Syringa oblata;? Mature seed;? Growth hormone;? Tissue culture