微酸性次氯酸液對屏障設施動態環境殺菌效果的研究*

白 冰 師長宏

(空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

噴霧殺菌是實驗動物屏障設施內進行微生物控制的常用方法，所使用的消毒溶液主要為含氯消毒劑。該類消毒劑主要成分為次氯酸鹽。由于其工作濃度高、堿性強，具有易揮發、刺激性氣味大、性質不穩定、腐蝕性強等缺點。微酸性次氯酸液作為一種新型含氯消毒劑，其有效氯濃度低，消毒性能優良、且腐蝕性小、極少有刺激性氣味[1]，近年來頗受關注。本研究所用微酸性次氯酸液殘留低，與有機物接觸可瞬間殺菌、瞬間失活，即使吸入也無毒性。消毒時由于使用的是超微粒子的噴霧，不會潤濕皮膚和眼睛。為檢測該消毒液及其噴霧在屏障設施內的殺菌效果，實驗選取動態飼養環境，進行單次和連續消毒，以獲取屏障設施內最優微生物控制方案。

1 材料與方法

1.1 材料

NDX-1500PLB型微酸性次氯酸液生成器由OSG株式會社生產。生產能力70 L/h，功率為3 600 W，生產工藝見圖1。標準菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)菌株，沙門菌(Saimonella，ATCC13311)菌株，均購自ATCC。營養瓊脂平板由本實驗室制備。細菌懸液制備，按《中華人民共和國藥典》2015版四部無菌檢查法和微生物限度檢查法和劉毅萍法[2-3]。

圖1 次氯酸水生產工藝Fig.1 Production process of hypochlorite solution

1.2 檢測方法

1.2.1制備細菌懸液，濃度達到1×107cfu/mL，然后將無菌濾紙制成1 cm×1 cm 方形紙片，將制片浸入菌液中放置10 min，后取出制片晾干制成菌片備用。吸取消毒劑5.0 mL于無菌小平皿內，將其置(20±1)℃水浴中5 min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗預定的時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含5.0 mL稀釋液試管中，作用10 min。用電動混合器混合20 s，或將試管振打，吸取該最終樣液1.0 mL，接種于營養瓊脂平板中，(36±1)℃恒溫培養箱培養24～48 h后菌落計數，并計算殺菌率[4]，每組實驗重復3次。

1.2.2微酸性次氯酸液有效氯含量和pH值等理化指標檢測參照文獻[4]。

1.2.3檢測微酸性次氯酸液對金黃色葡萄球菌和沙門菌殺滅作用。

1.2.3.1 模式Ⅰ：用微酸性次氯酸液噴霧設備對選取的屏障設施進行噴霧殺菌，單次工作15 min，30 min后不同時間點使用營養瓊脂平板檢測落下菌數，并計算殺菌率，每組實驗重復3次。

1.2.3.2 模式Ⅱ：用微酸性次氯酸液噴霧設備對選取的屏障設施進行連續噴霧殺菌，每日工作6次，每次工作5 min，休息5 min，每日連續工作1 h，30 min后不同時間點檢測落下菌數，連續工作21 d，每隔7 d檢測落下菌數并計算殺菌率，每組實驗重復3次。

1.2.3.3 模式Ⅲ:用酸化水對選取的屏障設施進行連續噴霧殺菌，每日工作2次(上、下午各一次)，每次連續工作30 min、連續工作21 d，每隔7 d檢測落下菌并計算殺菌率，每組實驗重復3次。

1.2.4實驗選取的屏障設施為：5.6 m×6.0 m×2.5 m=84.0 m3；溫度為23.1 ℃，相對濕度為56.3%；小鼠飼養數量為500只，開放飼養。

1.3 殺菌率計算

在微生物殺滅實驗中，殺菌率(killing rate，KR)用百分率表示微生物被殺滅的數量，用于評價殺菌效果。實驗組菌落數B1(cfu)，對照組菌落數B2(cfu)，按照下列公式計算KR：

2 結果

2.1 酸化水理化檢驗結果

有效氯含量為6.84×10-2g/L，pH值為6.24。

2.2 微酸性次氯酸液的殺菌率

微酸性次氯酸液對金黃色葡萄球菌和沙門菌作用15 min后的殺菌率可達到90%以上，見表1和圖2。

表1 對標準株的消殺結果Table 1 Sterilization result for standard bactericidal strain

圖2 微酸性次氯酸液對金黃色葡萄球菌和沙門菌平板菌落的影響Fig.2 Effect of microacid hypochloric acid on bacterial result of Staphylococcus aureus and Salmonella

2.3 模式Ⅰ檢測結果

用微酸性次氯酸液噴霧設備單次工作15 min 后在2 h內殺菌率維持在90%，48～72 h殺菌率低于30%(表2和圖3)。

表2 模式Ⅰ空氣落下菌殺菌結果(噴霧15 min)Table 2 Sterilization results of mode Ⅰ air fall bacteria (sprayed for 15 min)

2.4 模式Ⅱ檢測結果

21 d后殺菌率達到60%以上(表3和圖4)。

表3 模式Ⅱ空氣落下菌殺菌結果Table 3 Sterilization results of mode Ⅱ air fall bacteria

圖4 模式Ⅱ不同時間點落下菌數Fig.4 The number of mode Ⅱ air fall bacteria at different time

2.5 模式Ⅲ檢測結果

殺菌率可達到90%以上，見表4和圖5。

表4 模式Ⅲ空氣落下菌殺菌結果Table 4 Sterilization results of mode Ⅲ air fall bacteria

圖5 模式Ⅲ不同時間點落下菌數Fig.5 The number of mode Ⅲ air fall bacteria at different time

3 討論

含氯消毒劑廣泛應用于實驗動物屏障設施的日常消毒，通常是霧化后通過沾濕墻面的附著菌進行殺菌，屬于遲效性殺菌，并且會呈大顆粒狀浮游于室內。而當人進入房間后，會吸入大量的消毒劑或是附著于皮膚上或進入眼睛引起不適，對動物也會產生同樣的危害，其毒性和殘留性是在使用過程中存在的主要問題。因此，在確保屏障設施消毒效果的基礎上，尋求高效、安全、可靠的消毒劑具有重要意義。

本實驗選用的微酸性次氯酸消毒液殘留性低、有瞬間殺菌力，與有機物接觸會瞬間殺菌、瞬間失活，低濃度條件下即使吸入也無毒性。同時，為減少次氯酸殘留并進一步提高消毒液的安全性[5]，將其分子結構中的次氯酸離子變為次氯酸分子。但消毒液噴霧后呈霧狀漂流在室內，若霧中的次氯酸分子不與空中浮游菌接觸則部分會氣化蒸發，失去作用。為減少氣化并提高次氯酸分子的比例，需要將液體pH值控制在7.0 以下。當液體pH值在5～6.5時溶液中次氯酸分子的比例高達90%以上，此時溶液的殺菌效果最好[6]。本實驗使用的消毒液pH值為6.24，這也是其具有較強殺菌效果的主要原因。

實驗中選取兩種標準菌株模擬墻壁和器物表面附著的細菌，進行直接殺菌效果檢測。結果顯示，消毒液在15 min內能有效殺滅細菌，殺菌率可達到90%以上，表明消毒液在短時間內對物體表面細菌具有良好的殺菌能力，可作為屏障設施的特效殺菌劑。為進一步檢測其對屏障設施內空氣落下菌的殺菌效果，分別進行單次和連續殺菌效果檢測，以獲取單次殺菌后的最長維持時間和最佳殺菌時間。結果表明，單次噴霧工作后2 h內，殺菌率可維持在90%以上，超過48 h菌落數與對照無差異。而每日單次工作1 h，連續工作21 d，殺菌率也只能達到60%以上。為了提高殺菌率，實驗將殺菌次數改為每日兩次，每次持續工作30 min， 21 d后殺菌率可達到90%以上。以上結果充分說明，消毒液能有效殺滅屏障設施內的細菌，但需要進行長期連續的殺滅，并且要盡可能做到高頻次，這樣才能減少設施內動物感染的機率。如果在殺菌過程中出現間隔，最好控制在48 h之內，超出該時間點后細菌數量會有明顯恢復。雖然該消毒液對人及動物無害，但有研究表明其對碳鋼、銅為中度腐蝕，對鋁為輕度腐蝕，由于對金屬有輕度或中度腐蝕作用[7]，因此在屏障設施內使用時應盡量避免對上述金屬直接作用。另有研究表明，其對芽孢的殺滅取決于所在載體不同而有所差異[7]，因此，制定殺滅策略時要根據不同環境進行有針對性的調整，才能收到預期效果。實驗中所使用的噴霧設備也得到了充分的檢測，證明其完全符合實驗動物設施殺菌要求。雖然消毒液不能100%殺滅環境中的細菌，但其可靠性和高效率是明確的，尤其對實驗動物屏障設施內微生物控制具有良好的作用，也為其他實驗室的消毒提供了參考方案。