南蛇藤醇介導的PTEN過表達增強順鉑對食管癌細胞的化學敏感性并抑制裸鼠成瘤能力*

高元喜 張 煒 王玉霞 嚴佳麗 劉新宇

(1. 宜昌市中醫醫院腫瘤科，宜昌 443000)(2. 武漢科技大學附屬醫學腫瘤科，武漢 430064)

食管癌發生于人消化道，是一種在世界范圍內常見、惡性程度高、極具侵襲性、極難治療的惡性腫瘤之一[1]。近年來在我國的發病率逐漸上升，2017年全國范圍內其發病率及死亡率在所有癌癥中位居前五[2]。由于食管癌患者早期癥狀不明顯，不易被發現，因此大部分患者被確診時已是中晚期。而且癌細胞易發生早期遠處轉移，且極易復發，即使通過手術切除原發腫瘤以及常規化療方法治療，預后效果仍然不佳，嚴重降低了患者生存質量[3-4]。因此篩選出高效且毒副作用小的抗食管癌藥物意義重大。目前，食管癌的化療通常以順鉑等鉑類藥物為基礎藥物，輔以5-氟尿嘧啶(5-FU)[5]、多西他賽[6]、紫杉醇[7]等。但由于癌細胞會對這些藥物產生耐藥性，使其治療率和緩解率大幅下降。南蛇藤醇是從南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)中提取出來的一種甲醇提取物質，具有多種生物學特性，包括抗腫瘤，抗炎，鎮痛，抗生育，抗菌和抗病毒特性[8]。有相關報道稱，南蛇藤的某些成分可有效的抗腫瘤轉移[9]、增殖[10]、侵襲[11]、抑制EMT[12]、誘導癌細胞發生凋亡[13]等。目前仍缺少關于南蛇藤醇對食管癌作用的研究報道，因此本研究通過南蛇藤醇聯合順鉑處理食管癌細胞EC109，探索南蛇藤醇介導的PTEN過表達對食管癌腫瘤生長、癌細胞存活、侵襲、EMT以及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用36只4周齡SPF級BALB/c雌性裸鼠，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0009。

1.2 主要儀器

Olympus BX53 M顯微鏡 (日本Olympus公司)，高速低溫離心機 (美國Beckman公司)，OLYMPLUSIX73熒光顯微鏡 (日本 Olympus公司)，AMA440 N高壓滅菌鍋 (英國Astell公司)，電泳槽、電轉儀 (美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統GDS-800 UVP (美國UVP公司)。

1.3 藥品與試劑

食管癌EC109細胞、人食管上皮細胞系HET-1 A(中國科學院上海細胞庫)，RPMI-1640培養基(HyClone)，南蛇藤醇(廣州軍區藥品儀器檢驗所)，順鉑(Sigma)，PTEN、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、cleaved PARP、cleaved caspase 3抗體(美國NEB 公司)，HRP標記的山羊抗小鼠二抗 (美國Santa Cruz 公司)；蛋白Marker、Fermentas、EDTA 緩沖液(pH 8.0)(美國Sigma 公司)，PVDF膜(美國BD公司)，Hoechst染色試劑盒、RIPA強裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1細胞培養：EC109、DDP細胞在補充有10%胎牛血清的DMEM培養基中生長。所有細胞均在含有5%CO2的培養箱中37 ℃培養。細胞匯合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.4.2動物模型建立與藥物干預:將食管癌細胞EC109/DDP(5×109/L)于裸鼠一側腹股溝部皮下注射到小鼠體內。腹腔注射PBS或南蛇藤醇或順鉑(5 mg/kg)至荷瘤小鼠體內。將其分為四組：EC109/DDP+PBS，EC109/DDP+順鉑， EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇組(1 mg/kg)，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇組(5 mg/kg)。每組9只。每隔5 d測量腫瘤體積，30 d后處死裸鼠，剝離移植瘤，測量其質量并計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率(%)=(EC109/DDP+PBS組平均瘤質量-藥物組平均瘤質量)/(EC109/DDP+PBS組平均瘤質量)×100%。

1.4.3免疫組化:采用鏈霉親和素-生物素-復合過氧化物酶試劑盒對腫瘤組織中Ki67、caspase-3、VEGE進行免疫組織化學染色。Image-Pro Plus 圖像分析系統上對異種移植物的免疫染色進行分析。

1.4.4CCK8分析檢測細胞存活率：將對數生長期的EC109、HET-1 A細胞傳代培養于96孔板中，培養24 h后用不同劑量的南蛇藤醇(0.5、1、2.5、5、10、20、50、80和100 μmol/L)處理人食管上皮細胞系(HET-1 A)24 h，根據試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK8試劑并于培養箱中繼續孵育2 h，用酶標儀檢測各組吸光度，繪制折線圖并計算細胞生長速度 (增殖倍數=細胞吸光度/0 h 細胞吸光度)。選取對正常細胞影響不大的南蛇藤醇濃度 (1、2.5和5 μmol/L) 用作后續實驗。順鉑(4 μg/mL)預處理EC109/DDP細胞后分別用不同劑量的南蛇藤醇處理EC109/DDP細胞，對照組用PBS代替順鉑，將其分為五組：對照組，順鉑(4 μg/mL)組，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組，順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組，順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組，CCK8試劑盒檢測細胞存活率。

1.4.5免疫印跡法：使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后，使用BCA蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度。含有20 mg蛋白質的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5% 脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過夜，第二天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設置曝光參數，檢測目的條帶對應化學發光強弱。

1.4.6Transwell：順鉑(4 μg/mL)預處理EC109/DDP細胞后，分別用不同劑量的南蛇藤醇處理EC109/DDP細胞，對照組用PBS代替順鉑。將處理過的細胞消化離心，無血清培養基重懸細胞，以 1×104孔的細胞數量種入上室，下室加入有血清的培養基。48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細胞，將 transwell 小室倒置風干，并放入含有 500 μL 染色液(0.1%結晶紫)的12孔板中，染色 20 min，取出后在 PBS 中清洗3次，并風干。在transwell小室直徑上取5個視野，在顯微鏡下拍照計數。

1.4.7Hoechst染色檢測調亡：按1.4.6使用藥物處理細胞，將處理后的細胞用預冷的PBS洗滌2次，每次5 min。細胞在4 ℃下于 4%多聚甲醛中固定1 h。然后每孔加入1 mL Hoechst 33258熒光染料，然后棄去染色液，在暗處用PBS洗滌2次，每次5 min。用熒光顯微鏡觀察細胞并拍照。細胞的核濃縮和分裂被用作細胞凋亡的指標。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 南蛇藤醇增強順鉑對體內腫瘤形成的抑制作用

如圖1A所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組腫瘤質量均顯著降低(P<0.05)。順鉑(5 mg/kg)組的腫瘤生長抑制率為3.84%，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)的腫瘤生長抑制率為25.64%，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組的腫瘤生長抑制率為53.84%；如圖1B所示，與EC109/DDP+PBS組比較，在南蛇藤醇處理后25～30 d，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組腫瘤體積顯著減小(P<0.05)。如圖1C所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組PTEN蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。如圖1D所示，與EC109/DDP+PBS組比較，EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(1 mg/kg)和EC109/DDP+順鉑+南蛇藤醇(5 mg/kg)組Ki67，VEGF和Caspase 3陽性細胞數均顯著減少(P<0.05)。

圖1 南蛇藤醇對體內腫瘤形成的作用注： 與EC109/DDP+PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Effect of methanol extract of Cel.orbiculatus on tumor formation in vivoNote: Compared with the EC109/DDP+PBS group，*P<0.05，**P<0.01

2.2 南蛇藤醇增強順鉑對食管癌細胞EC109生長的抑制作用

如圖2A 所示，HET-1A細胞存活率以南蛇藤醇濃度依賴的方式降低，當MIL濃度超過20 μmol/L時，HET-1A細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組EC109細胞存活率均顯著降低(P<0.05)。如圖2B所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 南蛇藤醇增強順鉑對食管癌細胞EC109生長的抑制作用注：與對照組比較,*P<0.05Fig.2 Methanol extract of Cel. orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 growth of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

2.3 南蛇藤醇增強順鉑對食管癌細胞EC109侵襲和EMT的抑制作用

如圖3A所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組的侵襲細胞數均顯著減少(P<0.05)。如圖3B所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組E-cadherin蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。

圖3 南蛇藤醇增強順鉑對食管癌細胞EC109侵襲和EMT的抑制作用注：與對照組比較,*P<0.05Fig.3 Methanol extract of Cel. orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 invasion and EMT of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

2.4 南蛇藤醇促進順鉑誘導的食管癌細胞EC109凋亡

如圖4A所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組凋亡細胞數均顯著增加(P<0.05)。如圖4B所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組cleaved PARP和cleaved caspase 3蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。

圖4 南蛇藤醇對順鉑誘導的食管癌細胞EC109凋亡的影響注：與對照組比較,*P<0.05Fig.4 Methanol extract of Cel.orbiculatus enhanced the inhibitory effect of cisplatin on EC109 invasion and EMT of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group, *P<0.05

2.5 干擾PTEN促進食管癌細胞生長和侵襲

如圖5A所示，與對照組比較，順鉑+南蛇藤醇(1 μmol/L)組、順鉑+南蛇藤醇(2.5 μmol/L)組和順鉑+南蛇藤醇(5 μmol/L)組PTEN蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)。如圖5B所示，與南蛇藤醇(5 μmol/L)組比較，南蛇藤醇+sh-PTEN組PTEN蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；南蛇藤醇+sh-PTEN組細胞存活率和侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05)，凋亡細胞數顯著減少(P<0.05)。

圖5 干擾PTEN對食管癌細胞存活率、侵襲力以及凋亡的影響注： 與對照組比較,*P<0.05Fig.5 Effect of interfering pten on survival rate, invasiveness and apoptosis of esophageal carcinoma cellsNote: Compared with the control group,*P<0.05

3 討論

食管癌在我國的致死率逐年上升，對人類健康造成嚴重影響[14-15]。由于食管癌患者早期癥狀不明顯，患者確診時多是癌癥中晚期，所以臨床上一般對其采用手術治療以及放抗癌藥物和化療結合的方式進行治療。但仍存在后期易復發、易轉移、易產生耐藥性、化療藥物的毒副作用大等問題[16]。因此，許多研究開始探索藥物聯合治療來解決這些問題。目前，研究報道稱南蛇藤提取物在胃腺癌[9]、肝癌[13]、膠質母細胞瘤[11]等治療方面有很好的功效。目前關于南蛇藤醇對食管癌的功效還缺少報道，因此，本研究探索南蛇藤醇介導的PTEN過表達對食管癌的作用。

癌細胞無限增殖是癌癥發生發展的重要機制。研究發現在體內，南蛇藤醇可明顯降低實體瘤的體積和重量，且不良反應低，抑制Hepa1-6細胞的增殖，并在mRNA和蛋白水平上抑制VEGF的表達，降低了腫瘤血管生成[17]。同樣，Jin等[18]研究發現南蛇藤醇以時間和劑量依賴性方式降低食管鱗癌細胞的存活率，并且通過PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制增殖。與前人研究結果一致，本研究發現南蛇藤醇處理后的食管癌腫瘤模型小鼠體內腫瘤重量和體積均降低，Ki67、VEGF和Caspase 3陽性細胞數均減少，EC109細胞存活率降低以及Ki67和PCNA蛋白表達水平降低，PTEN蛋白表達水平升高，而當干擾PTEN后，PTEN蛋白表達水平降低，細胞存活率降低，表明南蛇藤醇介導的PTEN的過表達可增強順鉑對體內腫瘤形成和食管癌細胞EC109生長的抑制作用。

上皮細胞-間充質轉化在癌癥轉移中有重要作用，是上皮細胞極性喪失、惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的一個重要生物學過程[19]。研究發現南蛇藤醇可明顯抑制AGS細胞的侵襲，南蛇藤醇處理后E-cadherin蛋白表達升高， N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低，從而抑制上皮間質轉化過程[20]。目前在膠質母細胞瘤的研究中發現南蛇藤醇處理增加E-cadherin的表達，降低N-cadherin和vimentin的表達，抑制EMT的過程和膠質母細胞瘤細胞的侵襲[21]。本研究發現南蛇藤醇處理后侵襲細胞數明顯減少，E-cadherin蛋白表達水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平均降低，然而干擾PTEN后，PTEN蛋白表達水平下調，侵襲力降低，表明南蛇藤醇介導的PTEN的過表達可增強順鉑對食管癌細胞EC109侵襲和EMT的抑制作用。

誘導細胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要手段之一。南蛇藤醇觸發線粒體介導的凋亡途徑并激活caspase-3，抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達水平，并上調了Bax和caspase-3的表達水平，從而促進細胞凋亡[10]。研究發現南蛇藤醇處理后Bcl-2與Bax表達比值的降低，線粒體膜電位升高，南蛇藤醇可促進食管鱗癌細胞EC109凋亡。本研究發現南蛇藤醇處理后凋亡細胞數明顯增加，以及凋亡相關蛋白cleaved PARP和cleaved caspase 3蛋白表達水平升高，而干擾PTEN后，PTEN蛋白表達水平降低，凋亡率明顯下降，表明南蛇藤醇介導的PTEN過表達可促進順鉑誘導的食管癌細胞EC109凋亡。

綜上所述，南蛇藤醇介導的PTEN過表達可有效的抑制腫瘤生長、降低腫瘤細胞存活率、促進食管癌細胞凋亡、降低侵襲能力、抑制EMT過程的發生，增強順鉑對食管癌細胞的化學敏感性，表明南蛇藤醇治療可有效抑制食管癌的發展，且毒副作用較小，為南蛇藤醇應用于食管癌防治提供實驗依據。