獼猴從幼年到老年的卵巢組織學(xué)變化*

田 川 楊再玲 朱向情 李 曄 呂冠柯 王金祥 趙 晶 蔡學(xué)敏 潘興華

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)，組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴陽 550004)(2. 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032)

卵巢衰老是一個(gè)多因素相互作用，逐漸累積的復(fù)雜生物學(xué)過程，主要表現(xiàn)為卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量下降[1]。女性的生育能力隨著年齡的增長而自然下降，30～35歲婦女的生育力下降速度緩慢而穩(wěn)定，35歲以后，由于卵巢儲備和卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的下降，女性的生育力下降速度將加速[2]。目前，卵巢衰老的治療方法主要有激素替代[3]和細(xì)胞因子治療[4]等，但都存在各自的缺點(diǎn)，如引發(fā)心血管疾病等，不能從根本上解決卵巢衰老導(dǎo)致的不孕不育等問題。主要是因?yàn)槁殉菜ダ虾团耘c年齡相關(guān)的生育力下降的分子機(jī)制仍不清楚[5]。非人類靈長類動(dòng)物是揭示年齡如何塑造卵巢的理想模型，因?yàn)樗鼈兊纳锝M成與人類高度相似，并且不易受混雜因素影響[6]。獼猴與人類的生理性及衰老特征相似，基因相似度90%以上，可作為一種特別有希望用于衰老研究的模型生物。有研究發(fā)現(xiàn)獼猴和人類之間存在廣泛共享的免疫衰老的mRNA表達(dá)和DNA甲基化修飾[7]。因此，用獼猴作為卵巢衰老的研究對象，觀察獼猴的卵巢組織從幼年到老年的變化規(guī)律，可為卵巢衰老的臨床研究提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雌性獼猴，由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供幼年雌猴3只，平均年齡3歲，體質(zhì)量2～3 kg；青年獼猴3只，年齡7～9歲，體質(zhì)量4.5～7 kg；老年雌猴3只，年齡23～27歲，體質(zhì)量4～7 kg。所有獼猴均飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)期間環(huán)境清潔衛(wèi)生，動(dòng)物籠具清潔干燥，達(dá)到動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SYXK(軍)2012-0039，所有動(dòng)物研究經(jīng)依托單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)，批件號為倫審2019-032(科)-01。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材

通用型中性組織固定液、HE染液、Masson 染液(Servicebio)；Tunel 試劑盒(Vazyme)；鼠抗人CD34(美國BD公司)；無水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；DAPI(Servicebio)；中性樹膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)和組織攤片機(jī)購自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；烤箱購自上海慧泰儀器制造有限公司；脫色搖床購自谷歌生物；IX70-121倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司；冰凍切片機(jī)購自Thermo公司；離心機(jī)購自上海安停儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組與分離卵巢:篩選的幼年獼猴、青年獼猴與老年獼猴各3只在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)2周，觀察各組獼猴無異樣變化后，用過量3%戊巴比妥鈉(1 kg/mL)麻醉獼猴使其安樂死，首先暴露腹腔，找到卵巢位置，卵巢隨陰道、輸卵管一起取出，用鑷子和手術(shù)剪剝離卵巢，無菌紗布拭干卵巢周圍血跡，電子天平稱質(zhì)量(g)并拍照，再用鑷子和手術(shù)剪把卵巢橫向等比分成4份，約1 mm3左右，最后把卵巢放至4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.3.2卵巢組織HE染色:取卵巢組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，HE染色，顯微鏡下觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3卵巢組織Masson染色:首先，石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精 5 min，自來水洗3次。再將切片浸至 Masson A 液中浸泡過夜，次日用自來水洗3次。 同時(shí)，配制Masson B液與Masson C液等比混合液，切片浸染1 min后，用自來水洗3次，隨后1%鹽酸酒精分化，自來水洗3次。再將切片置于Masson D液中，浸染6 min，自來水漂洗3次，Masson E液浸染1 min，Masson F液染20～30 s。然后，切片用1%冰醋酸漂洗分化，兩缸無水乙醇脫水。接著透明封片：切片放入第3缸無水乙醇5 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。最后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.4卵巢組織Tunel染色:冰凍切片固定：將冰凍切片水平置于37 ℃烘箱烘烤15 min，4%多聚甲醛中固定 30 min，隨后脫色搖床上用 PBS(pH 7.4)洗滌 3 次，5 min/次。修復(fù)：用組化筆在組織周圍畫圈，以防止液體流走，在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃溫箱孵育25 min。再在脫色搖床上用PBS洗滌 3 次，5 min/次。破膜：向在圈內(nèi)滴加破膜工作液以覆蓋組織，室溫孵育20 min，再用PBS洗滌3次，5 min/次。標(biāo)記：用去離子按1∶4的比例水稀釋試劑盒內(nèi)5×Equilibration Buffer，滴加1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢測樣本區(qū)域，室溫孵育 10 min。加反應(yīng)液：參照說明書，將Recombinant TDT Enzyme、BrightRed Labeling Mix、5×Equilibration Buffer和去離子水按1∶5∶10∶34混合，混合液緩慢滴加到圈內(nèi)以覆蓋組織為止，隨后將切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃恒溫箱孵育2 h。DAPI 復(fù)染細(xì)胞核：切片用 PBS洗滌3次，5 min/次。充分吸去PBS后，在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液，室溫避光孵育10 min。封片：切片用PBS洗滌3次，5 min次。隨后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.5卵巢免疫組織化學(xué)染色: 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min，雙蒸水洗3次。抗原修復(fù)：組織切片放在EDTA抗原修復(fù)液中，然后在微波爐內(nèi)中火8 min，停火8 min，轉(zhuǎn)至中低火7 min進(jìn)行抗原修復(fù)，在室溫冷卻后，玻片用PBS中洗滌3次，5 min/次。畫圈與血清封閉：用組織筆在組織周圍畫圈，然后滴加BSA孵育30 min。加一、二抗：吸去封閉液，加一抗(1∶3 000)，孵育過夜，PBS中洗滌3次后， 5 min/次。加入二抗室溫避光孵育50 min。自發(fā)熒光淬滅：向圈中央滴加抗熒光淬滅封片劑封片。DAPI復(fù)染細(xì)胞核：在圈內(nèi)滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min。封片：切片用PBS洗滌3次，5 min/次，再滴加抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，最后鏡檢送掃描。血管計(jì)數(shù)：參照Weidner 等校對計(jì)數(shù)方法，先在低倍鏡下掃查整個(gè)切片，尋找3個(gè)血管高密度區(qū)，即“熱點(diǎn)”；然后在×200下計(jì)數(shù)染色呈陽性的血管數(shù)，對于微血管的識別不需具備完整的管腔和紅細(xì)胞，只要有明顯的血管內(nèi)皮細(xì)胞染色、并且能與相鄰的血管、腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)成分相分隔的，就可視為一個(gè)獨(dú)立的血管，分辨不清以及具有較厚肌層的血管不納入計(jì)數(shù)內(nèi)；計(jì)數(shù)3個(gè)視野下血管數(shù)目平均值作為 MVD 值(個(gè)/HP)，然后以Graphpad prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(P<0.05)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 幼年、青年、老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)

卵巢臟器指數(shù)為卵巢質(zhì)量與獼猴體質(zhì)量的比值，其大小可以反映卵巢的萎縮及其他退行性改變。幼年獼猴的卵巢臟器指數(shù)與青年獼猴的無顯著差異，都顯著高于老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)(圖1)。

圖1 獼猴卵巢臟器指數(shù)統(tǒng)計(jì)圖注：**P<0.01Fig.1 Statistics of ovarian index of macaquesNote:**P<0.01

2.2 卵巢組織HE染色

由圖2可知，幼年獼猴卵巢可見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍(lán)色箭頭)、次級卵泡(紅色箭頭)、成熟卵泡(綠色箭頭)、閉鎖卵泡(紫色箭頭)，青年獼猴卵巢可見原始、初級、次級、成熟卵泡，老年獼猴卵巢局部只見閉鎖卵泡，被大量脂肪組織填充(黃色箭頭)。幼年與青年獼猴卵巢實(shí)質(zhì)比例顯著高于老年獼猴。

圖2 卵巢組織HE染色(200 μm)Fig.2 HE staining of ovarian tissue(200 μm)

2.3 卵巢組織Masson染色

由圖3可知，Masson染色可以反映卵巢組織的纖維化，圖中藍(lán)色為膠原纖維，紅色為肌纖維、纖維素與紅細(xì)胞。幼年獼猴卵巢在皮質(zhì)區(qū)有少量膠原纖維沉積，大量纖維素與紅細(xì)胞。青年獼猴在髓質(zhì)與皮質(zhì)區(qū)有少量膠原纖維沉積，排列稀疏，不規(guī)律。老年對照組膠原纖維在髓質(zhì)和間質(zhì)中都沉積有大量膠原纖維，沉積面積大，排列縝密且紊亂，局部可見少量肌纖維、纖維素與紅細(xì)胞。對膠原纖維所占面積比進(jìn)行分析,結(jié)果顯示老年獼猴最高(P<0.01)，青年獼猴低于幼年獼猴(P<0.05)。

圖3 卵巢組織Masson染色(50 μm)注：*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Masson staining of ovarian tissue (50 μm)Note：*P<0.05，**P<0.01

2.4 卵巢組織Tunel染色

由圖4可知，Tunel染色中凋亡細(xì)胞被染成紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。幼年獼猴卵巢與青年獼猴卵巢中幾乎沒有細(xì)胞凋亡；老年獼猴的卵巢大部分細(xì)胞染成紅色。對凋亡細(xì)胞占比進(jìn)行分析，結(jié)果顯示幼年獼猴卵巢的細(xì)胞凋亡率與青年獼猴的無顯著差異，老年獼猴卵巢的細(xì)胞凋亡率最高(P<0.01)。

圖4 卵巢組織Tunel染色(100 μm)注：**P<0.01Fig.4 Tunel staining of ovarian tissue(100 μm)Note：**P<0.01

2.5 卵巢組織免疫組織化學(xué)染色

利用免疫組織化學(xué)染色法來標(biāo)記CD34以分析卵巢組織中的血管個(gè)數(shù)，CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，被標(biāo)記后染成紅色。對CD34陽性顆粒及血管個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示幼年獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)為160，青年獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)為109，老年獼猴血管個(gè)數(shù)76(圖5)。

圖5 卵巢組織免疫組織化學(xué)染色(50 μm)注：*P<0.05，**P<0.01Fig.5 Immunohistochemical staining of ovarian tissue(50 μm)Note：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

隨著社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，晚婚晚育現(xiàn)象越來越普遍，各種誘因?qū)е赂啐g女性卵巢衰老不孕不育的人數(shù)越來越多。目前針對卵巢衰老的治療多為性激素替代，細(xì)胞因子治療和中醫(yī)治療等，但都治標(biāo)不治本，其原因主要是卵巢衰老的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制不完全清楚，探索新的治療方法依然是需要研究的重點(diǎn)。獼猴屬于非人類靈長類動(dòng)物，其衰老特征和卵巢組成與人類相似，以獼猴為卵巢衰老研究對象，觀察獼猴的卵巢從幼年到老年的組織結(jié)構(gòu)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將更接近于對女性卵巢衰老的研究。

幼年獼猴的卵巢臟器指數(shù)與青年獼猴的無顯著差異，都顯著高于老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)，提示獼猴到了老年后卵巢體積逐漸萎縮。女性生殖(卵巢)衰老的特征是由于卵泡和卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量顯著下降，生殖功能明顯降低[8]。隨著卵巢衰老，卵泡池逐漸減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[9]。本實(shí)驗(yàn)HE結(jié)果顯示，幼年獼猴卵巢組織中有大量的原始與初級卵泡，青年獼猴卵巢中的初級卵泡與次級卵泡數(shù)量下降，出現(xiàn)較多的次級卵泡，部分卵泡發(fā)育成熟，老年獼猴卵泡閉鎖，出現(xiàn)閉鎖卵泡，有大量脂肪組織填充。說明隨著年齡的增長，獼猴卵巢卵泡逐漸被消耗，最后發(fā)生閉鎖。

纖維化過度積累會破壞組織結(jié)構(gòu)和功能，包括心臟，肺和腎臟在內(nèi)的多個(gè)器官均表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的纖維化[10]。Masson 染色結(jié)果顯示，幼年獼猴卵巢皮質(zhì)區(qū)有少量膠原纖維沉積，大量纖維素與紅細(xì)胞。青年獼猴髓質(zhì)與皮質(zhì)區(qū)有少量膠原纖維沉積，排列稀疏，不規(guī)律。老年獼猴髓質(zhì)和間質(zhì)中都沉積有大量膠原纖維，沉積面積大，排列縝密且紊亂，局部可見少量肌纖維、纖維素與紅細(xì)胞。可見，獼猴從幼年到青年階段纖維化程度逐漸減弱，而后從青年到老年階段纖維化程度逐漸增加。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢纖維化具有增加CD206+∶CD68+的細(xì)胞比例，CD8+T細(xì)胞浸潤和纖維化DPP4+αSMA+成纖維細(xì)胞[11]。有研究證明纖維化是卵巢間質(zhì)衰老的早期標(biāo)志，這種微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致與年齡相關(guān)的配子質(zhì)量下降[10]。卵巢纖維化是卵巢成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致，許多細(xì)胞因子，如MMPs、TGF-β1與VEGF都參與了卵巢纖維化[12]。在幼年和老年人的非人類靈長類動(dòng)物卵巢的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，鑒定了卵巢中7種具有不同基因表達(dá)特征的卵巢細(xì)胞，包括卵母細(xì)胞和7種類型的卵巢體細(xì)胞[13]。可見，幼年獼猴卵巢的纖維化程度高于青年獼猴卵巢的纖維化，可能是由于獼猴在幼年期卵巢，胸腺等器官未完全發(fā)育成熟，抗炎癥、氧化應(yīng)激與免疫調(diào)控等能力不足，不能及時(shí)修復(fù)卵巢損傷，導(dǎo)致局部發(fā)生纖維化。隨著年齡增長，到了青年階段，獼猴各個(gè)器官發(fā)育完全，免疫調(diào)控與抗炎等能力逐漸增強(qiáng)，使得纖維化減弱。到了老年階段，獼猴整體器官功能發(fā)生退變，卵巢纖維化增加導(dǎo)致獼猴卵巢功能下降，結(jié)構(gòu)被破壞。

卵泡閉鎖是哺乳動(dòng)物卵巢中顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞丟失以及卵巢早衰的主要過程，研究表明，顆粒細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致卵泡閉鎖[14]。本研究中，Tunnel 染色結(jié)果顯示幼年獼猴卵巢的細(xì)胞凋亡率與青年獼猴的凋亡率無顯著差異，老年獼猴卵巢的細(xì)胞凋亡率最高。也有結(jié)果表明，衰老的卵泡間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的與衰老相關(guān)的分泌表型相關(guān)的細(xì)胞分泌趨化因子配體可能通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡而在卵巢衰老過程中損害卵泡的發(fā)育和成熟[15]。可見，老年獼猴的卵巢大量卵泡發(fā)生閉鎖，可能是由于卵巢細(xì)胞凋亡增加引起的。

血管隨著年齡的增長而丟失，與年齡有關(guān)的血管丟失是特定于區(qū)域的，并且可以至少部分地通過對毛細(xì)血管堵塞的區(qū)域敏感性來解釋[16]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示幼年獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)為160，青年獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)為109，老年獼猴血管個(gè)數(shù)76，提示獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)在幼年時(shí)最多，然后逐漸退化甚至丟失。有研究發(fā)現(xiàn)小血管疾病的危險(xiǎn)因素可通過削弱毛細(xì)血管功能來減少組織氧合，衰老和血管危險(xiǎn)因素會損害白質(zhì)過高灌注和毛細(xì)血管功能，從而造成缺氧組織損傷，繼而影響其消耗的白質(zhì)束的功能和代謝需求[17]。推測獼猴卵巢血管個(gè)數(shù)增齡性減少，可能會導(dǎo)致卵巢供血及營養(yǎng)因子不足，從而發(fā)生卵巢組織損傷，結(jié)構(gòu)被破壞。

綜上所述，獼猴從幼年到老年，卵泡逐漸被消耗，間質(zhì)區(qū)排列散亂，髓質(zhì)區(qū)被脂肪組織填充。卵巢纖維化程度從幼年到青年階段減弱，青年以后纖維化程度逐漸增強(qiáng)。卵巢細(xì)胞凋亡率從幼年到青年階段無顯著差異，青年到老年階段細(xì)胞凋亡率上升。卵巢組織中的血管從幼年開始以后逐漸退化甚至丟失。推測獼猴卵巢組織結(jié)構(gòu)和卵泡從幼年到老年的變化趨勢，可能是通過纖維化與卵巢細(xì)胞凋亡率增加，血管個(gè)數(shù)減少來調(diào)控的，但是具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。