卵巢切除小鼠冠狀動脈封堵誘導心肌梗塞模型的建立與評估*

王 菲 胡 威 張 鵬 王曉武 師長宏 劉宏斌

(1. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院心血管內科，蘭州 730050)(2. 空軍軍醫大學西京醫院心血管外科，西安 710032)(3. 空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)(4. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四○醫院普通外科，蘭州 730050)

心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是一種常見的心血管疾病。流行病學調查顯示，絕經后女性MI的發病率顯著上升，且與同齡男性相比，絕經后女性在缺血性心臟病中的纖維化更為嚴重[1]。絕經后婦女體內雌激素的大量減少導致心臟保護功能的降低，心血管疾病風險的增加，但在這種情況下單純雌激素治療無效，提示可能與雌激素變化有關，但具體機制不明確[2]。因此，建立相應的動物模型對于絕經期婦女的心臟保護研究具有重要意義[3]。

MI引起的炎癥反應和細胞凋亡在疾病進程的發展和預后中起重要作用。已證實炎癥和細胞凋亡對于MI后心室重構至關重要[4]。因此，在本研究中，我們將雌性C57BL/6 J小鼠卵巢切除后，封堵小鼠的左冠狀動脈前降支，制備絕經后女性MI的動物模型。通過觀察其心臟功能、心肌梗塞面積和心肌纖維化程度，檢測凋亡率、TNF-α和IL-10水平的變化，用于評估切除卵巢的雌性小鼠發生MI的特征。

1 材料和方法

1.1 試劑和動物

TUNEL測定試劑盒和DAPI均購自Roche公司，BCA蛋白定量試劑盒購自Merck Millipore公司，TGF-β購自Abcam公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素10(IL-10)檢測試劑盒均購自武漢Elabscience公司。7～8周齡雌性C57BL/6 J小鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)2019-001。將小鼠隨機分為3個實驗組，每組20只，分別為對照組、卵巢切除(OVX)組和卵巢切除聯合心肌梗塞(OVX+MI)組。

1.2 卵巢切除術和心肌梗死

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，進行雙側卵巢切除術獲得OVX模型小鼠[3]。在雙側卵巢切除后2 周，使用6-0絲線縫合法將小鼠的左冠狀動脈主降支封堵，在小鼠中誘發MI[5]，獲得OVX+MI小鼠。具體方法是用6-0絲線在距左冠狀動脈主降支2～3 mm處繞活結，然后將心臟迅速放回胸腔，手動排空空氣并關閉皮膚。活結縫合線的內部頭端應盡可能短，縫合線的另一端約0.8 cm長，并留在胸腔外側。缺血30 min后，平滑輕柔地拉動活結縫合線的長端來釋放活結，直到感覺到釋放的感覺，這時心肌開始重新灌注。對照組動物在不結扎冠狀動脈的情況下進行了相同的手術。

1.3 超聲心動圖測量和血液動力學監測

在MI手術前3 d(基線)和術后4 周，使用Vevo 770超聲成像系統對心臟功能進行無創監測。超聲心動圖評估是在吸入異氟烷(1%～2%)麻醉下進行，同時監測心率(≥500次/min)和體溫(37 ℃±1 ℃)。使用高分辨率體內成像系統進行二維超聲心動圖測量，記錄舒張期和收縮期的心內膜體積，計算左心室射血分數(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)[6]。

在心肌梗塞后第4周通過微型化的壓力容積導管術進行了血流動力學分析。將帶尖頭的導管插入小鼠右頸動脈，并在麻醉小鼠中逆行至左心室。觀察波形-體積環的形態，記錄左心室內壓最大上升速率(dp/dtmax)[7]。所有分析均使用Lab Chart 7軟件進行。

1.4 形態分析

小鼠心肌梗塞后，取出心臟，使用30 mmol/L KCl將其停在舒張期，然后用10%福爾馬林緩沖液灌注固定，使用Masson的三色染色切片測量梗死面積[8](即梗塞疤痕占左心室周長的百分比)。使用心肌中部計算梗塞厚度，取沿梗塞壁的3個等距測量結果的平均值。分別用Masson 三色染色和HE染色橫截面(4 μm厚)，使用BIOQUANT圖像分析軟件測量纖維化程度，并計算出左心室壁區域瘢痕組織大小的比例[3]。

1.5 免疫細胞化學和TUNEL測定

使用標準程序進行福爾馬林固定和石蠟包埋的心臟切片的免疫組織化學染色(IHC)。將固定的成纖維細胞與一抗TGF-β1(1∶200)在4 ℃下孵育過夜，然后與封閉溶液中與Cy3偶聯的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋液)孵育。將TUNEL檢測溶液添加到切片中，并將切片在37 ℃下孵育2 h，用DAPI進行核染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察切片，并從隨機選擇的10個視野中計數細胞以確定細胞凋亡指數，通過TUNEL法分析心肌細胞凋亡率。

1.6 促炎細胞因子TNF-α和IL-10的測定

參照文獻[9]的方法，使用夾心ELISA試劑盒評估不同實驗組小鼠血清中TNF-α和IL-10的水平。

1.7 統計分析

所有實驗均重復3次，所有數值均以平均值±標準誤差表示。通過ANOVA和Bonferroni校正對差異進行t檢驗。所有統計測試均使用GraphPad Prism 5.0軟件進行，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢切除術對MI雌性小鼠心臟功能的影響

將小鼠切除卵巢后2 周進行MI手術，此后4 周進行M型超聲檢查和血流動力學測試，結果見圖1。OVX組的LVEF值顯著低于對照組(P<0.05)，而OVX + MI組的LVEF值比OVX組更低(P<0.05；圖1B)。不同組間的LVFS值也有相似的趨勢(圖1C)。血流動力學分析顯示OVX組或OVX+MI組降低了dP/dt最大值(P<0.01；圖1D)。上述結果表明OVX可以降低小鼠的心臟功能，而OVX+MI可以進一步加重心臟功能受損。

圖1 卵巢切除術對MI雌性小鼠心臟功能的影響注：與對照組相比，*P <0.05和**P <0.01；與OVX組相比,#P <0.05和##P<0.01Fig.1 Effect of ovariectomy on heart function of female mice with MI treatmentNote:Compared with the control group, *P<0.05 and **P <0.01; Compared with OVX group, #P <0.05 and ##P<0.01

2.2 卵巢切除術對MI雌性小鼠心臟形態和纖維化的影響

與對照組相比，OVX組的心臟組織和心室壁較薄，心肌纖維化程度較高；Masson的三色染色顯示OVX+MI可顯著減少心臟組織和心室壁的厚度，增加心肌纖維化程度(與OVX組相比，P<0.01)。

心肌組織梗塞邊界區的形態結構通過HE染色進行了分析，OVX組心肌組織顯著松散，少數細胞排列紊亂，而OVX + MI組的心肌梗塞邊界區的組織明顯松弛，且細胞排列紊亂加劇(圖2A)，梗塞區的心室壁較薄，纖維化程度較高(圖2B、C)。與OVX組相比，OVX + MI組可引起心肌組織疏松和紊亂，水腫更明顯。

圖2 卵巢切除的雌性小鼠心肌梗塞的心臟纖維化和形態變化注：與對照組相比，**P <0.01；與OVX組相比，##P<0.01Fig.2 Cardiac fibrosis and morphological changes of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote: Compared with the control group, **P<0.01; Compared with OVX group, ##P<0.01

2.3 免疫熒光和TUNEL的結果

免疫熒光(IFC)染色結果如圖3所示，通過TUNEL染色原位檢測凋亡性心肌細胞的代表性照片，紅色熒光顯示TGF-β1表達，綠色熒光顯示TUNEL陽性細胞核，藍色熒光顯示總的心肌細胞核。由圖4可知，OVX組可誘導心肌細胞凋亡率增加和TGF-β1表達，與對照組相比有顯著差別(P<0.05 和P<0.01)；OVX+MI組可進一步增加心肌組織梗塞邊界區的凋亡率和TGF-β1表達，與OVX組相比，P<0.05有顯著差別。

圖3 卵巢切除的雌性心肌梗死小鼠心肌細胞TUNEL染色和TGF-β1表達(Bar=100 μm)Fig.3 TUNEL staining and TGF-β1 expression in cardiomyocytes of ovariectomized female mice with myocardial infarction(Bar=100 μm)

圖4 卵巢切除的雌性心肌梗塞小鼠心肌細胞凋亡比例和TGF-β1熒光強度注：對照組相比，*P <0.05和**P<0.01；與OVX組相比，#P <0.05Fig.4 Apoptosis ratio and TGF-β1 fluorescence intensity of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote: A. Compared with the control group, *P<0.05 and **P<0.01; Compared with OVX group, #P <0.05

2.4 血清TNF-α和IL-10水平

ELISA檢測結果表明，與對照組相比，OVX+MI組小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α和IL-10水平顯著增加(圖5)。

圖5 卵巢切除的雌性心肌梗塞小鼠血清中炎癥相關因子水平的變化注： 與OVX組相比，**P <0.01Fig.5 The inflammatory cytokines levels in serum of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote:Compared with OVX group,**P<0.01

3 討論

絕經后婦女發生MI的主要特征包括心臟功能受損、心肌纖維化和炎癥的發生，單純使用雌鼠去卵巢誘導的相關變化非常有限[3]。心肌纖維化是導致MI后心臟功能障礙的主要組織學標志物。MI后的心室重構包括心肌細胞凋亡、炎癥、肥大以及心肌基質膠原纖維的合成和降解[10]。Roy等[11]利用芯片技術分析了心肌梗塞后第2天和第7天，發現大鼠心臟組織的功能基因改變主要與炎癥，細胞凋亡和細胞外基質有關。Kajstura等[12]發現，心肌細胞凋亡在MI的發生中起重要作用。凋亡是心肌梗塞大小的決定因素，并且在梗塞邊界區域的心肌細胞凋亡與梗塞大小有關。心肌細胞的凋亡會增加梗塞面積，引起心肌的進行性缺失，擴大梗塞面積，使心室壁變薄，使心室擴張，并導致心臟逐漸重塑，發展為心力衰竭。本研究使用超聲心動圖和壓力容積導管測量顯示，切除卵巢的雌性小鼠的心臟功能顯著降低，IFC顯示這些小鼠的心肌纖維化和心肌細胞凋亡顯著增加，這些結果表明，雌激素缺乏會加重MI小鼠的心臟損傷。

心肌梗塞治療后，壞死細胞誘導炎性細胞因子觸發炎癥反應，引起心肌纖維化，心室重構，心臟功能障礙，最終導致心力衰竭。炎癥可以通過信號途徑(如通過TNF-α發生的信號途徑)調節細胞凋亡。細胞凋亡的反饋會影響炎癥的嚴重程度，這兩個因素共同影響梗塞面積和心功能恢復[13]。因此，炎癥反應和細胞凋亡應該是心梗后心室重構和心臟功能障礙的重要原因。本研究中，卵巢切除的小鼠可以觀察到明顯的凋亡和炎癥，而卵巢切除的MI小鼠則顯示出相對較高的凋亡率和炎癥反應，炎癥相關細胞因子如TNF-α和IL-10的呈現出高水平表達，上述特征與絕經期婦女發生MI后炎癥相關因子的變化相一致。

綜上所述，本研究將雌性小鼠卵巢切除后進行左冠狀動脈前降支封堵誘導MI的發生，成功制備了模擬絕經后女性發生MI的動物模型。超聲心動圖和血流動力學檢查表明卵巢切除聯合心肌梗塞可加重心臟功能受損，形態學檢查發現該模型小鼠心室壁變薄，心室擴張和心臟重塑，TNF-α和IL-10表達升高，與絕經期婦女發生MI后癥狀相一致，從而為絕經期婦女的心臟保護研究提供了良好的動物模型。