光電結合檢測大鼠原代神經元胞內鈣離子濃度方法的建立*

劉麗娜 許 晴 魏 華 李 華 薛奮勤 薛 冰

(首都醫科大學中心實驗室，北京 100069)

神經元內鈣離子的作用貫穿了其生命周期的整個生命過程，如轉錄、分化、信號的傳導及遞質的釋放和凋亡等等。體內鈣離子發生變化會導致很多疾病，而很多應激也會首先導致鈣相關蛋白發生改變[1]。顯微成像技術已經廣泛的應用在科學研究中，神經熒光染料結合成像技術已經廣泛應用到檢測各種活細胞胞內的鈣離子的變化[2-3]。在神經元中，鈣離子通過電壓和配體門控通道產生的胞內鈣離子變化最明顯。另外，細胞內儲存的鈣釋放也會導致胞內鈣離子升高。神經元處于靜息狀態時，胞內鈣離子濃度為100～200 nmol/L，在神經元受到刺激后，膜去極化，鈣離子通道打開，鈣離子內流，胞內鈣離子迅速升高到原來的10～100倍。我們通過搭建轉盤共聚焦系統結合電刺激，并對神經元細胞中的鈣離子進行成像。采用孵育染料使其進入細胞。先觀察細胞內自發的鈣離子變化，然后對細胞進行電刺激并記錄到了胞內鈣離子刺激前后的變化。電刺激是神經元功能研究中常見的刺激方式，可以通過改變刺激強度和刺激頻率來模擬生理和病理狀況。所以，結合成像系統來記錄神經元胞內鈣離子濃度意義重大并為進一步研究神經元的功能和神經環路奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Neurobasal培養基、B27、青鏈霉素購自美國Gibco公司； D-Hanks液購自美國HyClone公司；L-glutamic acid、L-glutamine、β-mercaptoethanol、Sodium pyruvate、多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；fluo-4 AM購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 原代神經元的制備

新生24 h以內的SD大鼠, 低溫麻醉，75%酒精浸泡消毒5 min后斷頭，移入放有無菌濾紙的培養皿中(濾紙用于吸去多余血水)。無菌條件下，將全腦取出，放入盛有冰浴預冷的D-Hanks(不含鈣、鎂離子和酚紅)的培養皿中。小心取出大腦皮層，體視顯微鏡下剝離腦膜。將皮層組織剪成0.5～1 mm3的組織塊，用尖頭拋光的Pasteur滴管輕輕吹打，40 μm細胞篩過濾除去組織碎片，細胞懸液1 000 r/min離心5～10 min，加神經元培養液重懸細胞, 以(1.5～2.5)×105個/mL接種于處理過的培養皿(接種前一天，用12.5 μg/mL Ploy-D-lysine處理細胞培養皿，室溫過夜后吸出液體，用無菌三蒸水洗三遍后，置超凈臺中晾干備用)中，置37 ℃、5%CO2培養箱培養。每天觀察細胞生長情況，每隔3 d換一次神經元培養液，7～10 d后可用于實驗。

1.3 刺激電極的制作

準備2根1 m左右的導線(長度取決于刺激器到顯微鏡鏡頭的距離)，5 cm鎢絲1根，絕緣膠布，絕緣塑料底。根據培養皿的直徑和深度，把鎢絲彎成2個幾字形，用絕緣膠布把鎢絲固定在絕緣塑料底上。把鎢絲的兩端和導線的兩端連接在一起，導線另外兩端連接到刺激器的隔離器的正負極上。

1.4 轉盤共聚焦顯微鏡系統的配置

該系統由高速雙轉盤共聚焦掃描單元、激光器、超高靈敏度EMCCD、全自動倒置熒光顯微鏡、X-Y閉環控制電動載物臺、壓電陶瓷Z軸、精確同步控制器、圖像工作站和相關軟件組成。快速共聚焦成像是通過將共聚焦雙轉盤系統安裝到倒置顯微鏡的熒光端口上獲得的。轉盤是由兩個同軸排列的圓盤組成，每個圓盤有大約20 000個針孔，在上方圓盤的針孔上裝有微透鏡，與下方圓盤的針孔一一對應，使得入射光直接聚焦到下圓盤的針孔。固體激光器提供激發光，二向色鏡通過旋轉盤中的針孔陣列(直徑50 μm)投射激發光，該旋轉盤以1 kHz的速度旋轉通過物鏡(60×/1.35)到樣品上。圖像傳感器為電子倍增電荷耦合裝置(electron-multiplying charged-coupled device，EMCCD)相機，像素為512×512，鈣離子熒光指示劑fluo-4激發波長為488 nm。曝光時間為200 ms，頻率為1 Hz時獲取圖像。

1.5 鈣離子濃度的檢測

Fluo-4 AM用Cytobuffer稀釋1000倍，終濃度為1 μmol/L，用37 ℃ Hanks液潤洗神經元2次，加入稀釋后的fluo-4AM，37 ℃孵育30 min，室溫下再孵育30 min。然后，將細胞培養皿放在XY-Piezo Z Stages 顯微鏡用電動載物臺上，采用EMCCD相機，通過復消色差物鏡(1.35NA)60×油浸鏡頭成像。488 nm激光，在大于510 nm波長處檢測發射熒光。

1.6 鈣離子分析

使用圖像分析軟件ImageJ分析細胞內的熒光強度。在ImageJ中打開圖像文件(.tiff文件)，單擊選擇工具，選擇感興趣區域(ROI)。先選擇背景，再選擇細胞。打開“analyze>tools> ROI manager”，單擊“add”。可以在單個圖像上選擇多個ROI以進行測量。重復前面的步驟，直到所有ROI已添加到ROI Manager。單擊“more>multi measure”，選擇“measure all slices”，然后單擊“ok”以獲取fluo-4的平均熒光強度表，然后保存文件。

2 結果

2.1 原代神經元胞內自發鈣離子變化

顯微鏡下的神經元形態清晰，結果見圖1。下圖是神經元圖像按空間重建后，選取神經元胞內鈣離子隨著空間的變化。不同的神經元自發鈣離子變化的出現不同，在8～10 min內，約10%的神經元出現自發性鈣離子升高。自發性鈣離子升高可能跟一種電壓型鉀離子通道相關[4]。

圖1 原代神經元胞內自發鈣離子變化注：A.神經元(白色箭頭處)熒光圖像；B.神經元胞內鈣離子的變化Fig.1 Spontaneous intracellular calciumchanges in primary neuronsNote：A. Fluorescent image of neurons (white arrows)；B. Intracellular calcium changes in neurons

2.2 原代神經元電刺激后細胞胞質內鈣離子變化

原代神經元受到電刺激后胞內鈣離子變化見圖2，電刺激誘發神經元，胞內鈣震蕩。一般情況下，神經元胞內鈣離子會隨著電刺激開始迅速上升，但也有個別神經元如神經元2(圖2B、C)，神經元胞內鈣離子出現在電刺激的后期。從圖2C還可以看出不同的神經元鈣離子升高的頻率和振幅也均有不同，可能跟神經元的類型不同有關[5]。刺激結束后，胞內鈣離子還是有周期性升高，但升高的幅度減小。

圖2 原代神經元受到電刺激后胞內鈣離子變化注：A.實驗用電刺激電極(白色箭頭所指為幾字形的刺激電極)和分析所選的兩個神經元；B.給予電刺激前后，神經元1和2在不同的時間點所得熒光圖像；C.神經元受到電刺激后胞內鈣離子隨著時間的變化圖Fig.2 Changes in intracellular calcium after theneurons were electrically stimulatedNote:A.The stimulus electrodes (white arrows refer to the stimulus electrodes) and the two selected neurons for analysis；B. Fluorescent images obtain for neurons 1 and 2 at different points in time, before and after triggering；C. Intracellular calcium of neurons changes after stimulated with time

3 討論

普通共聚焦顯微鏡因分辨率低和光毒性，不適合快速的活細胞成像[6-7]，而轉盤共聚焦顯微鏡有1 000個小孔同時掃描樣本，速度遠遠高于單點掃描的普通共聚焦顯微鏡，超高速、高分辨率成像使其成為研究細胞動態過程的極佳工具。在神經元的研究中，轉盤共聚焦已用于監測受體的運動和作用以及細胞的遷移[8-9]。

研究神經元內的鈣離子變化需要良好的空間分辨率和高幀速率(10～100幀/s)和高信噪比的成像系統。盡可能降低染料濃度進而減小或消除染料的副作用[10]，激光的激發強度也應保持最小，以確保神經元保持健康并顯示出與生理相關的行為[11-12]。

系統配備的圖像傳感器為EMCCD，像元尺寸為16 μm×16 μm, 有效感光面積大，背照式感光使其量子效率達到90%以上，因此適合弱光信號的采集。制冷溫度為-80 ℃，因此暗電流幾乎可以忽略不計，噪聲低，信噪比高，可以減少曝光時間或激光強度，使得光漂白性低，適合長時間采集。全幅512×512采集速度為56幀/s，采集速度可以達到ms級。綜上所述，EMCCD適合長時間快速的弱光信號的采集。在本次實驗中記錄到的神經元結構清晰可見，給予電刺激后電刺激后會導致細胞胞體鈣離子的可逆增加。

靈敏度除了受到相機的影響，還受到顯微鏡光學、機械或電子噪聲的限制。本研究使用奧林巴斯研究性倒置活細胞顯微鏡，其高性能二向色鏡、復眼透鏡系統能夠提供均勻亮度的熒光圖像，以及匹配的復消色差物鏡等光學器件，并配備有Z軸補償系統，連續自動對焦模式使觀察平面保持不變，還能避免由于溫度改變或添加試劑導致焦點漂移，使其能夠在長時間的成像過程中保持連續的聚焦，非常適合測量對焦點要求高的活細胞成像。

現在的研究中，使神經元興奮的除了特異的激動劑之外主要方式有高鉀溶液和電刺激等[13]，它們的最終作用都是使神經元去極化，從而使鈣離子通道打開，鈣離子內流，胞內鈣離子增加。我們使用電刺激器master-8產生脈沖刺激，它的優點是8個通道可以各自獨立運行，也可以靈活、同步的產生復雜的脈沖模式，可通過改變脈沖的頻率、強度等來模擬生理和病理的狀況，是體外研究神經元興奮性理想的刺激方式。另外，在神經元的突觸可塑性研究中，電刺激也是必不可少的刺激方式。

本次研究表明，高靈敏度的EMCCD圖像檢測器，高度穩定、高效的激光傳輸系統，及精確同步控制器和易于使用的系統控制軟件，這些組成使得系統無論是靈敏度還是速度都非常高，可成功用于觀察神經元內電刺激引起的鈣離子變化。許多其他可興奮性活細胞，如心肌細胞和腺體細胞也可使用此刺激方式。此外，還可以通過添加有針對性的激光光漂白、活化等工具，分離或破壞細胞過程以提取有關這些過程的定量信息。