滋補脾陰中藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制分析＊

趙春燕，戰(zhàn)麗彬

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院·中醫(yī)脾藏象現(xiàn)代研究實驗室 南京 210023）

“脾陰”一詞最早見于南宋·齊仲甫《女科百問》[1]：“有因冷氣痞結(jié)于脾陰，濕郁而為黃”。現(xiàn)代研究表示脾是一個涉及消化吸收、水鹽代謝、能量轉(zhuǎn)化、血液、免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的綜合功能單位[2]，其病理多表現(xiàn)為涉及多器官、多系統(tǒng)的復(fù)雜病理改變。脾陰是脾中水谷精微所化生的營血、津液、脂膏等精微物質(zhì)，與脾陽一起維持脾臟的正常生理功能。脾臟有病多為虛證，脾陰虛是其常見證候之一。近年來，具有滋補脾陰功效的中藥被廣泛運用于消化系統(tǒng)疾病及癡呆、糖尿病等多種常見病中[3]，雖療效顯著，但其分子機制尚不明確，故本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種宏觀的研究策略，從系統(tǒng)水平探究和梳理滋補脾陰中藥發(fā)揮藥理作用的機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的新興學(xué)科，它通過建立單味中藥或復(fù)方和其活性成分以及藥物靶標(biāo)、生物學(xué)通路等網(wǎng)絡(luò)的方法從分子層面闡明中藥的作用機制，由于其分析方法符合中醫(yī)藥治療模式“多組分”“多靶點”的特點并且可以充分利用網(wǎng)絡(luò)資源，成為探索中藥復(fù)方的復(fù)雜機制[4,5]、單味中藥或中藥配伍禁忌的毒理作用[6,7]、新藥研發(fā)[8,9]等新的思路。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路預(yù)測滋補脾陰方劑中使用頻次較高且歷代醫(yī)家對其滋補脾陰功效有明確論述的5 味中藥的活性成分、潛在靶點以及靶點參與的通路，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)拓撲指數(shù)分析和分子對接實驗，在分子層面上闡明滋補脾陰中藥的共性機制，為探究滋補脾陰中藥的作用機理提供數(shù)據(jù)支撐，從而為更加深入的探究脾陰學(xué)說提供思路。

1 材料與方法

1.1 代表性滋補脾陰中藥選擇及其活性成分遴選

本文按照以下3個原則（臨床常用中藥，滋補脾陰方劑中使用頻次較高，歷代著述中對其功效由明確記述）篩選出有代表性的滋補脾陰中藥。各味中藥活性化合物來源于TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID 數(shù)據(jù)庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）以及文獻。以藥物動力學(xué)（Absorption and distribution and metabolism and excretion，ADEM）參數(shù)中類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為指標(biāo)進行篩選，該指標(biāo)用來評價分子是否含有特定的功能基團或與大部分藥物相同或相似的物理特征，被廣泛用于藥物開發(fā)[10]。

1.2 滋補脾陰中藥靶點預(yù)測

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和STITCH（http://stitch.embl.de/）數(shù)據(jù)庫獲得成分作用靶點。其中，TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的化合物靶點信息主要來源于DrugBank 數(shù)據(jù)庫。同時，將查詢到的化合物信息輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行查詢，獲得化合物的SMILES 結(jié)構(gòu)式。再將SMILES 結(jié)構(gòu)式輸入STITCH 中進行靶點預(yù)測，該數(shù)據(jù)庫是化合物與蛋白質(zhì)之間已知或預(yù)測的相互作用的數(shù)據(jù)庫，可利用化學(xué)相似性預(yù)測化合物靶點。將查詢對象限定為人源基因（Homo sapiens）作為研究對象，選擇Tanimoto score ≥0.9 的檢索結(jié)果為相似化合物進行靶點預(yù)測。

1.3 滋補脾陰中藥功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及節(jié)點重要性評價

為明確滋補脾陰中藥靶點間的相互作用關(guān)系，將其潛在靶點導(dǎo)入功能蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫（String，https://string-db.org），選擇較高置信度0.800，將蛋白種類限定為人源（Homo sapiens），導(dǎo)出靶點關(guān)聯(lián)信息，在Cytoscape 3.7.1軟件中導(dǎo)入節(jié)點信息進行可視化，僅保留最大的連通片，并用ClusterMaker 插件對網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點進行聚類排列。獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

本研究采用PageRank[11]算法評價蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，該算法是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性排序的經(jīng)典算法，作為全局算法的1 種，它的策略可概括為“某1個節(jié)點的鄰節(jié)點越重要，則這個節(jié)點越重要”[12]。將蛋白互作信息導(dǎo)入R軟件（https://www.r-project.org）3.5.3，利用igraph 安裝包構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并計算每個蛋白的PageRank 值，大于二倍平均值的蛋白被認為是滋補脾陰中藥作用的關(guān)鍵靶點。為突出滋補脾陰中藥藥理機制的共性，利用R 軟件查找各中藥間的重合靶點，繪制韋恩圖（VennDiagram 安裝包），5味中藥共同作用的靶點同樣被認為是關(guān)鍵靶點。將滋補脾陰中藥關(guān)鍵靶點及其來源化合物信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中構(gòu)建“中藥-化合物-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 京都基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將滋補脾陰中藥潛在靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行KEGG 通路富集分析，P ＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫獲得富集通路的詳細信息。并將最為富集的20 條通路信息導(dǎo)入R軟件（ggplot2安裝包）中繪制氣泡圖。

1.5 滋補脾陰中藥疾病關(guān)聯(lián)度分析

為明確滋補脾陰中藥在疾病中的應(yīng)用價值，通過治療靶點數(shù)據(jù)庫（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）獲取PageRank 值大于平均值的靶點的相關(guān)疾病信息，該數(shù)據(jù)庫中的疾病帶有ICD-11（國際疾病分類）編碼，基于該編碼對所有疾病分類，利用R 軟件（ggplot2 安裝包）繪制柱狀圖，將各類疾病累計出現(xiàn)的次數(shù)可視化。

1.6 分子對接驗證關(guān)鍵靶點

分子對接是一種評價藥物活性小分子與靶蛋白結(jié)合能力的方法，本實驗采用AutoDock4.2.6（http://autodock.scripps.edu）軟件對5 味滋補脾陰中藥的共同靶點進行半柔性對接。蛋白構(gòu)象來源于Protein Data Bank（http://www.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫，通過文獻篩選合適的PDB ID。活性化合物MOL2 文件來源于TCMSP 數(shù)據(jù)庫。首先使用AutoDock Tools（ADT）對蛋白進行加氫、去水和加電荷預(yù)處理，并將化合物和蛋白輸出為PDBQT 格式，之后用AutoGrid 計算能量格點，采用遺傳算法對化合物和靶蛋白進行對接，并對其結(jié)合能力進行打分。采用Pymol軟件對關(guān)鍵化合物和蛋白間的對接結(jié)果進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 滋補脾陰中藥選擇及活性成分遴選

黃一卓[1]及金景熙[13]等人對古今醫(yī)案進行統(tǒng)計，歸納出滋補脾陰方劑中使用頻次較高的中藥（圖1），本研究基于上述數(shù)據(jù)結(jié)合歷代醫(yī)家的論述，將山藥、白扁豆、白芍、茯苓及芡實5味中藥納入研究范圍。通過數(shù)據(jù)庫和文獻檢索及ADME 參數(shù)篩選，經(jīng)過去重后最終得到擁有靶蛋白的69個活性化合物，其中山藥活性成 分22 個，茯 苓18 個，白 芍22 個，扁 豆4 個，芡實8個。

圖1 古今滋補脾陰方劑中使用頻次較高的中藥

2.2 活性成分靶點預(yù)測

整合TCMSP 數(shù)據(jù)庫和STITCH 數(shù)據(jù)庫中獲得各味中藥潛在的靶點，經(jīng)上述條件篩選并剔除各自的重復(fù)項后獲得山藥潛在靶點83 個，茯苓118 個，白芍149個，白扁豆30 個，芡實80 個，最終共獲得靶點276 個，對各藥味靶點重復(fù)情況進行分析（圖2）。中藥間各有重復(fù)靶點，其中血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、環(huán)氧化酶1（PTGS1）和環(huán)氧化酶2（PTGS2）為5 味中藥共同的作用靶點，從而推測以上3 個靶點在這類中藥發(fā)揮藥理作用的過程中至關(guān)重要。

2.3 滋補脾陰中藥功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及節(jié)點重要性評價

為直觀表示滋補脾陰中藥作用靶點間的關(guān)系，將靶點信息輸入Cytoscape 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），利用PageRank 算法給該網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點打分，獲得16 個大于二倍平均值的靶點，其中包括RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、白細胞介素-6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、胰島素（INS）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）等。加上2.2 中篩選出的共同作用靶點，共獲得18個關(guān)鍵靶點（表1）。從圖中可看出這些關(guān)鍵節(jié)點（紅色）分別存在于較大的聚類單位中，處于同一個聚類單位中的蛋白可能具有更強的相互作用并參與同樣的生物學(xué)功能。

圖2 滋補脾陰中藥靶點韋恩圖

“滋補脾陰中藥-化合物-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖4）中包含61個節(jié)點（5個中藥、38個化合物和18個蛋白）和206 條邊。其中PTGS2 有32 個來源化合物，PTGS1 有21 個來源化合物，說明這2 個靶點在5 味滋補脾陰中藥間存在著確切的共性。熊果酸（ursolic acid）擁有9個關(guān)鍵靶點，是網(wǎng)絡(luò)中貢獻度最大的化合物。分析網(wǎng)絡(luò)中化合物信息（表2）。

圖3 滋補脾陰中藥潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 滋補脾陰中藥作用的關(guān)鍵靶點

2.4 京都基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將滋補脾陰中藥的靶點通過DAVID 及KEGG 數(shù)據(jù)庫進行通路注釋及分析，得到98 條顯著富集的通路。根據(jù)P 值大小，將最為富集的20 條通路用富集點圖表示（圖5），圖中氣泡大小代表通路中富集基因的數(shù)目，顏色按照P 值大小依次由紅色向綠色漸變。結(jié)果顯示，滋補脾陰中藥主要作用的通路有HIF-1 信號通路、癌癥通路、胰島素抵抗、PI3K-Akt 信號通路、結(jié)直腸癌、細胞色素P450 在外源化合物代謝中的作用、花生四烯酸代謝、mTOR信號通路等。

表2 關(guān)鍵靶點來源化合物信息

圖4 “滋補脾陰中藥-化合物-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)

圖5 滋補脾陰中藥潛在靶點的KEGG通路富集點圖

圖6 滋補脾陰中藥潛在作用的疾病統(tǒng)計

2.5 滋補脾陰中藥疾病關(guān)聯(lián)度分析

查找PPI 網(wǎng)絡(luò)中大于PageRank 平均值的99 個靶點的相關(guān)疾病，共獲得195 種疾病，按ICD-11 編碼可分為20 類，將頻數(shù)＞5 的類別繪制為柱狀圖（圖6）。其 中 腫 瘤（2A00-2F9Z，29.74%）、神 經(jīng) 系 統(tǒng) 疾 病（8A00-8E7Z，10.77%）、內(nèi)分泌、營養(yǎng)和代謝疾病（5A00-5D46，7.18%）、消化系統(tǒng)疾病（DA00-DE2Z，7.18%）、肌肉骨骼系統(tǒng)和結(jié)締組織疾病（FA00-FC0Z，7.18%）占比較高。在統(tǒng)計結(jié)果中，滋補脾陰法治療結(jié)直腸癌[18]、乳腺癌[19]等惡性腫瘤，2型糖尿病[20]等內(nèi)分泌疾病，認知功能障礙[21]、肌營養(yǎng)不良[22]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病及潰瘍性結(jié)腸炎[23]、腸易激綜合征[24]等消化道疾病皆可見臨床報道。除此之外，本次實驗結(jié)果顯示具有滋補脾陰作用的中藥還可能在食道炎、酒精性肝病、膽石癥、胰腺功能障礙等疾病中有擁有應(yīng)用潛力，值得從中醫(yī)傳統(tǒng)理論和分子生物學(xué)等層面展開深入探討。

2.6 關(guān)鍵靶點PTGS1/2的分子對接結(jié)果分析

對5 味中藥共同調(diào)節(jié)的靶點VEGFA（PDB ID：4KZN）、PTGS1（PDB ID：5WBE）和PTGS2（PDB ID：3LN1）進行分子對接驗證（表3）。自由結(jié)合能＜0 則代表小分子和蛋白間可以自由結(jié)合，＜-5表示有較好的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，熊果酸與三蛋白結(jié)合活性皆較好，齊墩果酸、β-谷甾醇、β-香樹脂醇乙酸酯、常春藤皂苷元、(-)-花旗松素、玉蘭脂素A、海風(fēng)藤酮和豆甾醇等化合物與PTGS1/2 結(jié)合活性較好，β-胡蘿卜素和薯蕷皂苷元與VEGFA 及PTGS2 結(jié)合能力較強。圖7 為熊果酸與PTGS2 的相互作用分子對接示意圖，小分子與氨基酸殘基CLU308、GLY121形成氫鍵。

表3 PTGS1/2與對應(yīng)化合物的分子對接結(jié)果

圖7 PTGS2與熊果酸相互作用分子對接示意圖

3 討論

古今方劑中單純補益脾陰的極少，明確記載有補益脾陰功效的中藥更是寥寥無幾。歷代醫(yī)家對各藥味的滋補脾陰之功有不同看法，但大都認為山藥藥效卓著，白扁豆、芡實、茯苓、白芍等藥也皆有文獻支撐。如明代醫(yī)家周慎齋在《慎齋遺書》稱：“凡嘈雜，脾陰不足，山藥宜多用”“茯苓、山藥固其脾陰”“芍藥，陰分藥也，通脾經(jīng)，性味酸寒，能和血，治虛腹痛也”。清代醫(yī)家陳其瑞在《本草撮要》中也提到：“山藥味甘，入足太陰經(jīng)，功專健脾，得羊肉補脾陰，得熟地固腎精”。明代賈所學(xué)《藥品化義》：“白茯苓，味獨甘淡，甘則能補，淡則能滲，甘淡屬土，用補脾陰，土旺生金，兼益肺氣”。清·張德裕《本草正義》：“芍藥古無赤白之分，而功用自別，白者冷而微酸，能益太陰之脾陰，而收渙散之大氣”。清·吳澄在《不居集》中論述：“扁豆、谷芽補脾陰，而不燥肺金”。清·王旭高《王旭高臨證醫(yī)案》：“加扁豆培養(yǎng)脾陰，土旺自能生金也”。明代張介賓在《景岳全書》中論芡實：“味甘，氣平，入脾腎兩臟。能健脾養(yǎng)陰止湯”。如故最終將以上5 味藥納入研究范圍。

本研究發(fā)現(xiàn)滋補脾陰中藥通過大量靶點和通路協(xié)同發(fā)揮作用，其中環(huán)氧化酶、花生四烯酸代謝、細胞色素P450 酶和5-羥色胺等是其影響的一個大的功能聚類單元。環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase，COX）又稱前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，是花生四烯酸代謝通路中的關(guān)鍵酶。戰(zhàn)麗彬教授[25]指出脾的生理功能之一可概括為肌肉組織、血液系統(tǒng)和免疫功能。而花生四烯酸在血液、肝臟、肌肉等器官和組織中起著重要的生理作用，同時也是合成前列腺素（prostaglandins），血栓烷素（thromboxanes）和白細胞三烯（leukotrienes）等二十碳衍生物的直接前體，對人體造血和免疫調(diào)節(jié)具有十分重要的意義[26]。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，花生四烯酸被證明直接參與了可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）介導(dǎo)的突觸傳遞[27]，該過程影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，其異常往往會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂。細胞色素P450 酶（Cytochrome P450，CYP）也在花生四烯酸肝臟和腎臟中的代謝發(fā)揮作用，CYP 是一類廣譜生物催化劑，并可以參與脂肪酸、外源物質(zhì)、治療藥物和信號分子的代謝，包括二十烷類化合物、白三烯和前列腺素類化合物[28]。滋補脾陰中藥具有6 個CYP 家 族 的 靶 點，分 別 是CYP1A1、CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP1B1 和CYP4F2。滋補脾陰中藥還能通過CYP 或作用于5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（SLC6A 4）、5-羥色胺受體（HTR3A）等參與5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的代謝過程，這種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)大量存在于大腦皮層質(zhì)及神經(jīng)突觸中，在學(xué)習(xí)記憶、情緒和內(nèi)分泌等生理功能以及異常情緒和認知等病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。《素問·宣明五氣》曰：“心藏神，肺藏魄，肝藏魂，脾藏意，腎藏志。”因此，脾陰不足可導(dǎo)致脾不藏意，氣血生化無源則腦髓失養(yǎng)，影響正常的認知能力，嚴重可發(fā)展為認知功能障礙，戰(zhàn)麗彬教授課題組用滋補脾陰方藥治療糖尿病認知功能障礙動物模型，通過對其展開行為學(xué)實驗，證實了補益脾陰的方法對糖尿病認知功能障礙有確切的治療效果[29,30]。

除調(diào)節(jié)免疫、造血功能和精神情緒外，滋補脾陰中藥還調(diào)節(jié)胰島素抵抗過程。《靈樞·本臟》曰：“脾脆則善病消癉易傷。”脾胃積熱日久，脾陰虧虛，津液受損，發(fā)為消渴。吉訓(xùn)超[31]等人認為胰島素的功能有賴于脾陽的推動，而胰島素代謝則與脾陰有關(guān)。在本研究中，認為滋補脾陰中藥對胰島素抵抗的治療作用與mTOR 信號通路和PI3K-Akt 信號通路有密切關(guān)聯(lián)，mTOR 通過激活下游效應(yīng)蛋白S6K1 從而顯著上調(diào)胰島素受體底物IRS 的Ser307（302）和Ser636/639 位點磷酸化水平，導(dǎo)致IRS 的降解，引發(fā)胰島素抵抗[32,33]。而PI3K/Akt 信號通路是胰島素信息傳導(dǎo)的主要通路，可以通過影響多個分子調(diào)整葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝從而調(diào)節(jié)胰島素水平[34]。以上可能是滋補脾陰中藥治療2 型糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等代謝相關(guān)性疾病的分子基礎(chǔ)。

滋補脾陰中藥還在胃腸道腫瘤及消化系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。其分子機制可能與HIF-1 信號通路密切相關(guān)，低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心誘導(dǎo)因子，在腫瘤形成中其亞型HIF-1α（HIF1A）通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）來促進血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖，有利于胃腸道腫瘤血管的生成和浸潤[35]。同時，HIF-1 促進血管生成的作用還有助于重建因疾病損傷的胃腸道黏膜血管[36]。HIF1A能夠誘導(dǎo)多種腸壁保護基因的轉(zhuǎn)錄，在腸壁中形成保護性黏液層[37]。HIF1A 還與PTGS2等靶點共同參與組織炎癥過程，抑制胃腸道炎癥，實驗證明，HIF1A 和PTGS2 在炎性腸病的腸腔和腺體的上皮細胞等組織中的表達皆顯著增加[38]。潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜中PTGS2 呈高表達，并且在炎癥細胞聚集的部位呈強陽性[39]。此外，5-HT在胃腸道中與特異性受體結(jié)合后有促進胃液產(chǎn)生、調(diào)節(jié)胃蛋白分泌、促進胃排空及小腸蠕動等作用[40]。

綜上，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，選取山藥、茯苓、白芍、扁豆、芡實5味中藥作為滋補脾陰中藥的代表進行研究，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)滋補脾陰中藥發(fā)揮作用主要是通過多個靶點和通路，參與人體物質(zhì)代謝、免疫、造血、炎癥反應(yīng)等過程，并可以影響神經(jīng)系統(tǒng)，增強學(xué)習(xí)與記憶能力。對胰島素抵抗、胃腸道癌變、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)病變等機體異常狀態(tài)和疾病有著多重協(xié)同效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)與人們對脾及脾陰功能的現(xiàn)代認識一致。本次研究為探究滋補脾陰中藥的作用機理提供數(shù)據(jù)支撐，從而為更加深入的探究脾陰學(xué)說提供思路。