巨噬細胞的抗結核納米遞藥系統的應用進展

向海濱 梁求真 李新霞 宋興華

目前，結核病(tuberculosis，TB)仍是全球十大死亡原因之一，甚至已超過人類免疫缺陷病毒(HIV)感染成為傳染病致死的主要原因。在2019年《全球結核病報告》[1]中估算，2018年我國新發結核病患者86.6萬例(位居全球第二)，而新發耐利福平結核病(RR-TB)及耐多藥結核病(MDR-TB)6.6萬例(位居全球第二)，我國也是全球結核病負擔最重的3個國家之一。一般結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)經空氣傳播，可累及肺部或肺外器官，如骨骼、泌尿道、卵巢，甚至腦膜。MTB是一種細胞內寄生菌，具有代謝緩慢、高度疏水性、細胞壁厚等特點，所以采用藥物治療其過程相當復雜且存在許多局限性[2]。近年來，應用納米技術設計出許多新的藥物遞送策略，使得藥物在病灶有效積累，以確保患者依從性增加、藥物不良反應降低、耐藥率降低等。筆者以MTB的致病機制為背景，對基于巨噬細胞的抗結核納米遞藥系統的研究進展進行綜述。

一、MTB的致病機制

首先MTB上的病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)被巨噬細胞上的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)所識別，誘導一系列巨噬細胞的自噬。但在這一過程中巨噬細胞有時不能殺死MTB，因為MTB可以抑制巨噬細胞中的噬菌體-溶酶體融合機制[3-4]。接著未被殺死的MTB在巨噬細胞中繁殖并最終使其裂解，導致細胞損傷又激發血液中單核細胞等移行到該區域。而單核細胞分化為巨噬細胞后再次吞噬細菌并被裂解，形成一個惡性循環。在感染后2～3周結核特異性抗原傳遞到T淋巴細胞時，輔助性T淋巴細胞(Th)1分泌的γ-干擾素和MTB表面的脂多糖共同刺激巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞并分泌白細胞介素(IL)-12、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、活性氮、活性氧等，促進炎癥反應造成組織破壞。同時極化的M2型巨噬細胞分泌IL-10、IL-1、轉化生長因子β(TGF-β)等抑制炎癥反應并促進組織修復愈合。因此，M1型巨噬細胞抑制MTB繼續生長，而M2型巨噬細胞抑制炎癥造成MTB免疫逃逸，最后達到一種動態平衡[5-6]。再經過一段時間，病灶中的上皮樣細胞和淋巴細胞聚集形成肉芽腫，MTB暫時進入潛伏期。當機體營養不良、免疫下降、類固醇使用或HIV感染等因素可破壞這種平衡，重新變成活動性結核病[7]。所以巨噬細胞是結核病發病機制的重要一環，這也是抗結核藥物設計的重要組成部分[8]。

二、傳統治療方案的局限性

根據世界衛生組織的抗結核治療指南，敏感性結核病治療的標準方案包括：每天服用異煙肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)2個月，然后每天服用INH和RFP 4個月。但是在MTB的進化過程中，由于其基因突變、染色體改變、細胞包膜的不滲透性、藥物外排、藥物降解和修飾等耐藥性機制，出現了耐RFP、耐多藥、廣泛耐藥結核病(XDR-TB)[9]。而目前對RR/MDR-TB的治療長達18～24個月，且至少需要5種藥物聯合給藥，大大增加了藥物不良反應及降低了患者依從性[10]。因此，傳統藥物仍然存在一些局限性，包括：(1)多藥聯合治療，治療時間長，增加耐藥性等；(2)有些抗生素為高親水性而細胞滲透性差，如β-內酰胺和氨基糖苷類抗生素；(3)有些抗生素能夠輕松地進入細胞，但細胞內滯留時間短，如氟喹諾酮類抗生素[11]；(4)傳統藥物遞送肝臟首過消除效應大；(5)由于生物屏障的選擇性通透會抑制藥物向一些部位有效遞送，例如血-腦、血-骨髓屏障；(6)高血藥濃度給藥到達治療效果，就存在不良反應且降低患者的依從性，如神經毒性、眼毒性、腎毒性和耳毒性。所以亟需開發新的藥物遞藥策略，將藥物直接有效地遞送到受感染的巨噬細胞，來實現精準醫療。

三、被動靶向遞藥系統

納米遞藥系統利用某些載體負載一種或多種藥物遞送到目標器官或組織，常見的納米遞藥系統包括納米顆粒、納米囊泡、納米乳劑、納米脂質體、納米懸浮液、納米晶體、膠束等[12-13]。被動靶向納米遞藥系統主要是利用其理化特性來實現體內藥物差異性分布。根據粒度、形狀、表面電荷等理化特性的不同，納米遞藥系統被巨噬細胞內吞，形成吞噬體的機制也有所不同，包括吞噬作用、網格蛋白介導的胞飲、小窩蛋白介導的胞飲、非網格蛋白及小窩蛋白依賴的胞飲、巨胞飲作用等5種[14-15]。此外，納米遞藥系統還可被特異性配體修飾后，通過配體-受體相互作用主動介導巨噬細胞內吞作用。但無論何種靶向機制都需要載體來負載藥物，這些載體優缺點各異(表 1)。

(一) 聚合物納米載體

聚合物是納米遞藥系統中使用最廣泛的藥物載體。聚合物的生物穩定性高可用于各種途徑給藥，而且合成工藝簡單并可輕松地調控藥物的粒徑、形狀、Zeta電位等理化特性來控制藥物釋放速度及靶向效率[16]。

1. 聚乳酸-羥基乙酸共聚物：是應用最為廣泛的合成聚合物載體，因為其水解代謝物為乳酸和乙醇酸，可以通過Krebs循環(即三羧酸循環)被身體代謝，所以也是全身毒性最小的聚合物載體。其次，PLGA納米粒子的藥物釋放速率也可以通過控制乳酸和乙醇酸單體比例，以及相對分子質量來調節[17]。目前，PLGA已經正式被美國食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準，用于人類的各種藥物輸送系統[18]。在2003年Pandey等[19]就報道了負載RFP、INH、PZA的PLGA納米粒子，其封裝效率分別達到56%、66%、68%。在通過灌胃給藥的小鼠模型中，藥代動力學表明血漿中RFP持續釋放達6 d以上，而INH和PZA釋放更是長達9 d以上，相比之下單純藥物組的半衰期明顯較短(RFP：2 h；INH：2～3 h)。這足以說明納米粒延長半衰期以降低給藥頻率，來有效地解決傳統抗結核藥物治療的局限性。而PLGA等作為親脂性聚合物，負載INH等親水藥物時會降低藥物包封率，從而增加制備成本及降低療效。在該研究中使用雙乳液揮發法制備PLGA 納米粒，雖然有效解決這一問題，但同樣降低了親脂性RFP的包封率。所以在制備過程中應根據藥物性質調整工藝及配方，以提高治療效果。此外，對于口服或吸入等經黏膜給藥途徑，還可利用對黏膜中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和唾液酸等具有高親和力的小麥胚芽凝集素，將其修飾在PLGA載體上以增加黏膜對納米粒的吸收來提高藥物生物利用度[20]。Marcianes等[21]還報道了負載加替沙星的PLGA納米遞藥系統用于穿過血腦屏障治療顱腦結核。他們用熒光劑羅丹明標記藥物，在經尾靜脈給藥60 min后處死大鼠，觀察到了熒光劑在大腦皮層組織持續蓄積而肺和肝臟較少。這種利用納米遞藥系統小粒徑特征來克服體內生物屏障的抗結核遞藥方式極具開發前景。

2. 樹枝狀大分子聚合物：是新型單分散超支化的合成聚合物體系，具有中心核和星形分支結構，其表面存在許多不同官能團可用來附著藥物、配體、聚乙二醇等。而樹枝狀聚合物內部空隙空間也比較大，可用于封裝或摻入小分子藥物來靶向遞送到巨噬細胞[22]。但因為樹枝狀大分子聚合物的粒徑一般在10 nm左右，霧化吸入后也極易被呼出體外，所以不適合于經呼吸道給藥。Bellini等[23]利用負載RFP的第4代聚酰胺基胺(G4-PAMAM)樹枝狀聚合物表現了出色的穩定性和pH值依賴性，其僅在酸性pH值下納米顆粒破裂釋RFP。因為巨噬細胞吞噬MTB后達到動態平衡，這使得細胞內呈現出低氧和低pH值狀態。所以當藥物通過靜脈給藥時，通過中性pH值的血液及組織液中運輸而避免降解，隨后被巨噬細胞吞噬并在酸性pH值下釋放，以實現抗結核藥物的“智能”靶向遞送。盡管如此，這項研究并沒有評估樹枝狀聚合物在體內的生物相容性。而另一項研究中就報道了負載RFP的第五代PAMAM聚合物中季銨基團與紅細胞產生溶血毒性(11.6%～15.3%)[24]。盡管使用聚乙二醇修飾樹枝狀聚合載體后可明顯降低這種毒性(2.5%)，但如應用在未來臨床中仍是致命的毒性。

(二) 脂質體納米載體

脂質體是在1965年被發現，由親水性的磷脂雙層構成的囊泡結構，多年來一直作為納米載體被廣泛研究。早在1990年首次報道了負載慶大霉素脂質體通過靜脈內給藥作用于鳥分枝桿菌感染的小鼠模型，并觀察到在肝和脾中細菌計數明顯減少[25]。在現代藥物遞送系統中，因為脂質體具有獨特的雙層核殼結構，對其進行改性后可負載親水性、親脂性、兩親性藥物。目前主要有固體脂質納米顆粒(SLN)和納米結構脂質載體(NLC)兩種類型。NLC作為克服SLN缺點的新一代脂質納米顆粒，其是固態和液態脂質的混合物，從而提供了更好的包封率和防止在儲存期間藥物溶出，這是獲得良好療效的前提[26]。Pinheiro等[27]就設計負載利福布汀的NLC，其包封率達到90%，并用甘露糖加以修飾，以實現被動和主動靶向至肺泡巨噬細胞。此外，載藥NLC中還添加了硬脂胺，表面Zeta電位從(-17.9±1.9) mV變為(37.6±1.0) mV，這個將傾向于被帶負電的巨噬細胞所吸附以達到被動靶向遞藥的目的。但不足的是作者當時并沒有通過體內或體外實驗來驗證巨噬細胞靶向機制。

由于脂質體對腸道脂肪酶敏感，因此必須通過呼吸道或靜脈內途徑給藥。其中經呼吸道吸入給藥是脂質體的常用方式，與聚合物相比氣溶膠脂質體更加穩定且安全。其不但能繞過胃腸道降解且不具有首過消除效應，還能通過表面積大且血管富集的肺泡吸收蓄積，甚至代替靜脈注射達到全身給藥。雖然納米脂質體因其粒徑小更易被肺泡巨噬細胞內吞，以實現被動靶向機制，但根據氣道粒子沉積的慣性撞擊、重力沉降、布朗擴散等機制，納米粒太小會導致大部分懸浮在氣流中而被呼出，從而降低了療效[28]。即使納米粒可有效地在下呼吸道中沉積，還需要顆粒表面特性以克服肺泡壁黏液屏障來促進滲透。總之與傳統藥物相比，可吸入納米脂質體已成為一種極具吸引力的策略，因為其提供了最大化治療效果，是可降低全身毒性的非侵入性治療手段[29-30]。但是如何控制其粒徑大小，使得既能有效在肺部沉積又能更加高效地靶向至巨噬細胞等問題亟待解決。

(三)多糖納米載體

多糖是來源于植物、動物、藻類、微生物等的一類獨特天然高分子材料，并通過單糖之間的糖苷鍵形成的。其具有以下獨特的優勢[31-32]：(1)多糖可以陰離子、陽離子、中性電荷狀態存在；(2)其本身就有抗菌特性并可能與抗生素類藥物產生協同作用，如殼聚糖；(3)含有羥基多糖可對上皮和黏膜等產生非共價生物黏附性；(4)具有極低的毒性和較高的生物相容性；(5)是廉價的可再生自然資源。Lu等[33]已經制備了負載氨基糖苷類藥物(鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素)的殼聚糖納米顆粒，藥物包封率分別為60%、63%、38%。為了提高殼聚糖基納米粒的抗生素負載效率，使用了硫酸右旋糖酐作為抗衡離子，以保護氨基糖苷類藥物的正電荷。體內實驗結果表明，口服負載鏈霉素的納米粒治療肺結核模型小鼠，3周之后處死小鼠并將肺組織勻漿后平鋪在7H11瓊脂平板上，細菌生長減少了1 log(CFU/ml)(CFU：菌落形成單位)。這有效地證明了利用殼聚糖載體采用離子凝膠技術來負載抗結核藥物給予口服給藥，其療效是確切的。但是當模擬胃酸性條件時(pH=1.2)，3種不同載藥殼聚糖納米粒的突釋效應都明顯增大，筆者認為這是因為殼聚糖的β-1,4-糖苷鍵在酸性環境中水解使得藥物過早釋放。此外，殼聚糖載體用于抗結核治療，還可以將殼聚糖作涂層修飾其他載體形成殼聚糖基納米復合材料來負載藥物。用多糖(殼聚糖)覆蓋鐵納米以在其表面上加載抗生素(如鏈霉素)會產生一種具有各種特性的新型磁性納米復合材料，作為診斷和治療結核感染的潛在工具[34]。

(四)碳納米載體

碳納米材料是一類新型材料，已在包括藥物輸送、組織工程、癌癥治療等各種生物醫學中應用[35]。目前，研究最為廣泛的碳納米無疑是碳石墨烯二維薄膜材料，其氧化形式為氧化石墨烯[36]。氧化石墨烯載體的起皺表面粗糙度約為845 nm，可以捕獲細菌并黏附，達到抑制細菌生長的目的。De Maio等[37]為了證實這種捕獲作用，將氧化石墨烯載體與MTB共培養后，用超聲裂解氧化石墨烯薄片以釋放細菌；結果隨超聲處理的時間增加，MTB的CFU也增加。雖然De Maio 等的實驗未觀察到氧化石墨烯載體對MTB的直接殺菌作用，但是這種“誘捕”獨特機制為將來結核病治療提供了新的思路。與氧化石墨烯相比，氧化石墨烯的還原形式直接對H37Ra標準株的MTB具有抗結核活性，其最小抑菌濃度為200 μg/ml。因此，氧化石墨烯的扁平特性使該材料能夠像納米刀一樣來切割細菌膜，并引起膜干擾和誘導氧化還原反應[38]。盡管碳納米載體通過呼吸道給藥存在早期肉芽腫反應、急性炎癥反應、進行性纖維化等不良反應[39]，但是碳納米載體作為一種新型抗結核策略，除了可以負載抗結核藥物達到雙重治療效果，還可以有效避免結核耐藥的負擔。

(五)金屬納米載體

銀已被用作了幾個世紀的抗菌劑，當它作為納米制劑時因穿透細胞膜作用增強，抗菌功能也隨之提高。Singh等[40]報道了銀和金納米顆粒作為MTB的比較研究，銀納米顆粒在3 μg/ml的濃度下可抑制90%的MTB生長,而金納米顆粒在100 μg/ml都沒有這種活性。盡管銀納米顆粒具有較高的抗結核活性，但與標準抗結核藥RFP最小抑菌濃度(0.4 μg/ml)相比仍有差距。Olakanmi等[41]報道了在鼠結核模型中用硝酸鎵腹腔注射后，肺、肝和脾臟中的MTB的CFU明顯減少。這是因為鐵是MTB代謝生長中必不可少的物質，所以在MTB的酶活性位點上可用鎵代替鐵使其失去功能，這是金屬粒子抗結核治療的另外一個機制。Narayana-samy 等[42]更是將鎵制備成納米制劑并被動靶向到受感染的巨噬細胞內，連續釋放藥物15 d，并有效抑制MTB及HIV的生長。他們還發現鎵納米顆粒還可以通過調節IκB激酶-β激活核因子κB(nuclear factorkappa-B，NF-κB)途徑，誘導巨噬細胞降低IL-6和IL-8的分泌水平[43]。為了增加抗結核金屬粒子的水溶性，Sato等[44]制備了用二價銅離子共價結合INH后，用納米脂質體載體包裹。在作者研究的結果中，使用脂質體負載后不但提高了27.3～55.4倍抗結核活性，而且降低了游離金屬粒的毒性。但是實驗僅僅只是粗略地評估了急性死亡事件及血液生化指標，對于該系統慢性毒性并未繼續研究。所以金屬納米粒同樣作為新型抗結核載體，其較低的抑菌濃度有望成為治療MDR-TB、XDR-TB的有力手段，但針對其解決慢性重金屬毒性問題仍需大量研究。

四、主動靶向遞藥系統

主動靶向遞藥系統就是納米載體與細胞組織之間的配體-受體相互作用。這些配體一般可綴合在藥物遞送系統的表面，然后通過巨噬細胞PRRs識別并介導內吞作用。PRRs一般包括C型凝集素受體、Toll樣受體(TLR)、Nod樣受體(NLR)、清道夫受體、Fc受體。其中的C型凝集素受體可識別富含碳水化合物的分子。甘露糖受體就是C型凝集素中的一個受體，還可以識別MTB細胞壁上面的脂阿拉伯甘露聚糖[3]。因此利用甘露糖作為配體修飾納米遞藥系統目前已經被許多研究報道。Vieira等[45]開發了甘露糖基化的脂質納米遞藥系統來負載RFP以改善結核病治療，研究結果表明甘露糖化納米脂質納米粒對人骨髓來源的巨噬細胞攝取增加，并能有效抑制細胞內MTB的生長。此外他們還對納米粒的內吞機制做了研究，分別用氯丙嗪和非律平限制網格蛋白和小窩依賴性內吞作用，而細胞松弛素D限制大胞飲作用，結果巨噬細胞對甘露糖化脂質體納米粒攝取減少，分別為65%、20%、25%。Maretti等[46]同樣報道了在體外實驗中使用負載RFP的甘露糖化納米脂質體，在鼠J774巨噬細胞中攝取增強。

目前還有其他用于巨噬細胞主動靶向的配體研究，例如：透明質酸、乳糖、聚乙二醇、霉菌酸(表2)。透明質酸是一種酸性黏多糖。Gao等[47]用透明質酸-生育酚琥珀酸酯膠束負載利福噴丁，通過吞噬作用和受體介導的內吞作用被小鼠肺泡巨噬細胞攝取，且具有時間和劑量依賴性。Gao等還指出透明質酸修飾的納米膠束還能誘導Th1細胞釋放高濃度細胞因子，這將有助于增強抗結核效應。另外一個靶向配體為分枝桿菌酸，又稱為霉菌酸，其是從MTB細胞壁分離下來的脂體。Lemmer等[48]利用雙乳溶劑揮發法將霉菌酸及INH包封在PLGA納米粒中，結果表明霉菌酸在納米顆粒表面表達，顯著增加了巨噬細胞的內吞作用。聚乙二醇作為抗結核主動靶向遞藥系統的重要組成部分，是一種常見“隱形”聚合物，可通過簡單的有機合成來修飾納米遞藥系統。聚乙二醇雖然延長了載藥納米遞藥系統的血液循環和減少了給藥頻次，但是同樣抑制了巨噬細胞的識別和吞噬作用[49]。但是至少解決了一些無機納米載體的低生物利用度和較短的循環時間問題[50]。

表2 巨噬細胞主動靶向的納米遞藥系統的相關報道

五、影響靶向遞送效率的因素

巨噬細胞作為MTB的儲存庫，而納米遞藥系統作為一種靶向細胞內的抗結核新劑型，其旨在:(1)改善藥物溶解度及穩定性；(2)控制釋放速率、延長循環時間、縮短給藥時間以提高患者依從性；(3)將藥物有效地遞送到巨噬細胞中，以降低藥物的全身毒性；(4)還可透過各組織器官的天然屏障到達目標區域。

目前，研究通過以下幾點來改善納米遞藥系統針對巨噬細胞的藥物遞送效率:(1)可以通過調節納米粒子的大小，一般20～100 nm的中等大小聚合物納米粒子更容易被細胞內吞[15]；(2)納米粒子幾何形狀也是一個不可忽略的因素，圓形、橢圓形粒子更容易被巨噬細胞內吞，而增加粒子長寬比會降低內吞作用[57]；(3)帶正電的納米顆粒與巨噬細胞的陰離子質膜相互作用而更易被內吞[54]；(4)調節納米遞藥系統與血漿蛋白(調理素)的相互作用；(5)通過綴合配體主動靶向到巨噬細胞。此外，還報道了在納米遞藥系統中添加細胞穿透肽，以通過網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用來增強細胞內吞[58]。

六、小結

盡管醫學水平在高速發展，但結核病對于公共醫療保健仍然是一個巨大威脅。按照世界衛生組織提出的在2035年消除全球結核病負擔這一目標，目前仍需要做大量工作。尤其針對MDR-TB和XDR-TB的出現，更加迫切地需要新的抗結核藥物。目前，人們已經探索了多種納米載體和生物材料用于抗結核病的單藥和多藥輸送，如聚合物、脂質體、多糖、金屬、碳等納米遞藥系統。上述納米遞藥系統涵蓋了化學、材料學、物理學、醫藥學和工程學等多個學科，系列實驗研究不僅證明了納米投藥系統可克服藥物本身的物理化學局限性、改善藥物遞送速率，而且可通過主動或被動靶向至受感染的巨噬細胞中(MTB的細胞儲存庫)。盡管這些納米遞藥系統已經取得許多良好的體內實驗結果，但如果將其用于臨床還需要嚴格進行質量控制及參數評估，如粒徑、形狀、表面電荷、表面成分、藥物包封率、穩定性、載體代謝后毒性等。此外，還需要考慮納米遞藥系統所處環境因素的影響，如pH值、溫度、生物介質中特殊物質的相互作用等。這些參數的協調是非常復雜且至關重要的，可能是一個長期而艱難的過程，就像脂質體的發現到FDA的批準成為藥物制劑用了30多年一樣。