一種新型的R-腎上腺素生物不對稱合成工藝

韋亞鋒 周勇

摘 ?????要： 目前合成R-腎上腺素的方法主要是手性拆分的方法和以氨基酸為原料通過生物法制備R-腎上腺素。傳統的手性拆分工藝因工藝路線長、拆分收率低導致R-腎上腺素生產成本高。氨基酸生物轉化法也因存在著雜質多且生產成本高的問題而未被廣泛應用。在此，建立了一種全新的生物不對稱合成方法直接制備手性藥物R-腎上腺素，以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮為原料，經甲胺化反應、成鹽反應合成得到鹽酸腎上腺酮，再經酶不對稱催化反應合成手性藥物R-腎上腺素。最優工藝參數為：氮氣保護下2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺摩爾比為1∶8，生物酶的用量為鹽酸腎上腺酮重量3.3%、酶催化反應溫度為（30±2）℃，酶催化反應時間為24 h，制備得到的R-腎上腺素手性純度不低于99.0%。以生物不對稱法合成R-腎上腺素，避免了手性拆分步驟，縮短了工藝流程，收率顯著提高，產品雜質少，方法可行，適合于工業化生產。

關 ?鍵 ?詞：R-腎上腺素; 生物不對稱合成; 手性純度

中圖分類號：TQ 016???????文獻標識碼：?A ??????文章編號： 1671-0460（2020）03-0615-04

Study on Bioasymmetric Synthesis of R-Epinephrine

WEI Ya-feng¹， ZHOU?Yong²

（1.?Bengbu BBCA Medicine Science Development Co.，?Ltd.， Anhui Bengbu 233010， China;

2. COFCO Biochemistry （Anhui）?Co.，?Ltd.， Anhui Bengbu 233010， China）

Abstract： At present， the?main methods for preparing R-epinephrine are chiral separation and bioconversion with amino acid. The traditional chiral separation resolution process has high product cost due to long process route and low yield. Amino acid bioconversion method is not widely used because of the problems of high impurities and high production cost. In this paper， a new bioasymmetric synthesis method to prepare chiral drug of R-epinephrine was established. In the specific preparation process， using 3，4-dihydroxyphenacyl chloride?as raw material，adrenalone hydrochloride was synthesized by methamination reaction and salt formation reaction. And then R-epinephrine was synthesized by enzymatic asymmetric reaction. The optimal process parameters were determined as follows： the?molar ratio of 3，4-dihydroxyphenacyl chloride and methylamine 1：8，the amount of biological enzyme 3.3% of the weight of adrenalone hydrochloride， the?enzyme catalyzed reaction temperature （30±2）℃，the enzyme catalyzed reaction time 24 h. The chiral purity of R-epinephrine?prepared under above process parameters was not less than 99.0%. Using the?bioasymmetric synthesis method to prepare chiral drug of R-epinephrine?avoided?the chiral separation step?and?shorten the process flow， the yield was?obviously improved， and the impurity of the product was low. So the method is feasible， and?suitable for industrial production.

Key words： ?R-epinephrine; ?bioasymmetric synthesis; ?chiral purity

腎上腺素是人體分泌出的一種激素，它和去甲腎上腺素一樣是一種α-腎上腺素能受體激動劑^[1]。它會使心臟收縮力上升，使心臟、肝和筋骨的血管擴張和皮膚、黏膜的血管收縮。在腎上腺素中，存在二個對映體S-腎上腺素和R-腎上腺素，主要具有生理活性的為R-腎上腺素，其活性較S-腎上腺素強12倍^[2]。R-腎上腺素臨床上是用于抗休克的急救藥物，它能夠增強心肌收縮力，為我們全身組織灌注源源不斷的血流。其分子結構見圖1。

合成R-腎上腺素原料藥的傳統工藝路線是以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（氯乙酰兒茶酚）為起始原料，制備出芐基腎上腺酮中間體，再經加氫還原反應制備R，S-腎上腺素消旋體，最后通過手性拆分得到R-腎上腺素^[3]。其合成工藝路線見圖2。

中國專利^[4]在傳統的工藝路線基礎上改進了催化劑，通過不對稱金屬手性催化劑對芐基腎上腺酮進行不對稱催化，然后通過加氫反應制備了R-腎上腺素。此種金屬催化的方法也有文獻報道用于L-去氧腎上腺素的合成^[5]，但關鍵中間體仍然是芐基腎上腺酮。其合成工藝路線見圖3。

中國專利^[6]報道了以酪氨酸為原料，通過酪氨酸羥化酶生成3，4-二羥基苯丙氨酸，再通過L-脫羧酶作用脫去羧基形成多巴胺，進一步通過多巴胺羥化酶得到去甲腎上腺素，最后通過苯乙醇胺-N-轉甲基酶甲基化合成腎上腺素。其合成工藝路線見圖4。

以芐基腎上腺酮為關鍵中間體經催化加氫反應制備消旋體腎上腺素，再經手性拆分得到R-腎上腺素的傳統工藝路線，其明顯的缺點是工藝路線長，手性拆分收率低，生產成本高。其改進后的以手性金屬催化劑對芐基腎上腺酮進行不對稱轉化的工藝，仍然存在著金屬催化劑昂貴的缺點。然以芐基腎上腺酮為關鍵中間體的合成工藝路線其另一個明顯的缺點是存在著芐基腎上腺酮和芐基腎上腺素雜質的存在，因為分子結構中芐基的存在導致還原過程中存在難以對芐基徹底脫除的可能。而完全以酶法對酪氨酸采取生物轉化的方法制備R-腎上腺素在市場上并不是主流工藝。鑒于以上原因，目前，國內市場上尚未有大量生產R-腎上腺素的生產企業。

針對以上合成R-腎上腺素的技術缺陷，本文創造性地建立一種全新的合成工藝，以腎上腺酮代替芐基腎上腺酮中間體，開展催化還原反應，避免了芐基的引入導致腎上腺素產物中雜質的增加。同時，以特定高選擇性的酶為催化劑，不對稱催化還原腎上腺酮，直接將其轉化為R-腎上腺素，避免傳統手性拆分的合成工藝路線，也克服了使用昂貴的不對稱金屬催化劑的缺點。

本文建立的合成工藝以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮為起始原料，經甲胺化反應制備鹽酸腎上腺酮中間體，再經酶法不對稱合成制備R-腎上腺素。其中甲胺化反應采用在無氧環境下反應，顯著提高了本步驟的收率，酶法不對稱合成所用的酶為具有對腎上腺酮高度選擇性的羰基還原脫氫酶，鹽酸腎上腺酮的不對稱轉化率幾乎達100%。本文所述合成R-腎上腺素的方法目前尚未見文獻報道，具體工藝路線見圖5。

1 ?實驗部分

1.1 ?主要儀器與試劑

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：型號DF-101S;

2-氯-3，4-二羥基苯乙酮：杭州康多醫藥化工有限公司，純度≥99.0%; 一甲胺乙醇溶液：衢州奧凱化工有限公司，濃度30%; EPI酶：自制;其余試劑購于國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

1.2 ?合成方法

1.2.1 ?化合物1（腎上腺酮）和化合物2（鹽酸腎上腺酮）的合成

將2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（氯乙酰兒茶酚）20.0?g（0.107?mol）、一甲胺乙醇溶液88.5?g（含一甲胺0.856?mol）一起加入到500?mL單口反應瓶中，30～35℃攪拌使物料均勻。通入氮氣置換反應瓶中的空氣4次后通氮氣保護，保溫30～35?℃下反應8?h，停止反應，過濾，得到灰綠色固體（化合物1），無水乙醇洗滌后抽干。將灰綠色固體潮品加入到燒杯中，加入乙醇和濃鹽酸的混合溶液（乙醇30?mL，濃鹽酸18?mL）進行成鹽反應，攪拌，調反應液的pH=2～3。攪拌0.5?h后，過濾，無水乙醇洗滌，得到化合物2（鹽酸腎上腺酮）白色晶體，無水乙醇洗滌，烘干后重量為19.0?g（0.0873?mol）。收率為81.6% ，HPLC歸一化含量為99.8%。

1.2.2 ?化合物3（R-腎上腺素）的合成

將鹽酸腎上腺酮15.0?g（0.069?mol）和30?mL水加入到250ml反應瓶中，攪拌至全溶。加入異丙醇30?mL、NAD（輔酶I）0.1?g和EPI酶液50?mL（含固體酶0.5?g），用濃氨水調節pH = 6.0～6.5，保溫（30±2）℃，反應24?h。反應結束，抽真空去除反應液中殘留的有機溶劑，得到澄清溶液。加入氨水調節反應液pH = 8.0～9.0，析出大量固體，過濾，烘干，得化合物3（R-腎上腺素）白色粉末狀結晶12.1?g（0.066?mol），收率96%。含量99.5%。

2 ?結構鑒定

產物R-腎上腺素結構鑒定：m.p.=208.5?℃;比旋度-52.0°（2015版中國藥典為-50.0°～ -53.5°）;元素分析結果為C ： 58.33% （理論值59.00%），H： 7.07% （ 理論值7.15%），N： 8.01% （ 理論值7.65%）;MS-ESI+圖顯示分子離子峰m/z 166.09 [M-OH]+、m/z 184.11 [M+H]+、m/z367.20[2M+H]+，與化合物的分子量183.2相符。

¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6，DMSO-d6+D2O）譜中，核磁共振1H、COSY、HSQC譜數據見表1，各原子歸屬見圖6。

3 ?結果與討論

3.1 ?甲胺化反應抗氧化措施的考察

由于甲胺化反應過程中，產物易被空氣氧化導致反應液顏色加深，收率較低，因此有必要采取考察抗氧化措施以確保反應順利進行。實驗方案如下：

取反應物料2-氯-3，4-二羥基苯乙酮10.0?g（0.053?6?mol）和30%甲胺乙醇溶液40.0?g（約含甲胺13.12?g，0.424?mol），溶劑乙醇100?mL，反應溫度35?℃，HPLC法跟蹤反應至化學平衡，分別采用抗氧化措施，考察甲胺化反應的進度。

抗氧化措施1：反應液中加入亞硫酸氫鈉0.5?g;抗氧化措施2： 氮氣保護下反應。

按照上述實驗方案，HPLC法跟蹤反應進度，考察結果見表2。根據實驗結果可知，采取措施2對甲胺化反應進行抗氧化保護，可明顯減少雜質的產生，提高腎上腺酮的含量（表2）。

3.2 ?物料比對甲胺化反應的影響

氮氣保護下，在改變反應物料2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（10.0?g，0.053?6?mol）和甲胺（30%甲胺乙醇）物料摩爾比的條件下，加入無水乙醇100?mL，反應溫度（35±2）℃，以HPLC歸一化法跟蹤反應，考察改變反應物料摩爾比對甲胺化反應的影響。考察結果見表3。

根據實驗結果可知，在2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺物料比為1∶8 時，反應較為完全，反應液中產物腎上腺酮含量最高。

3.3 ?EPI酶用量的考察

以EPI酶為不對稱還原催化劑，對鹽酸腎上腺酮進行不對稱催化反應。反應溫度（30±2）℃，以鹽酸腎上腺酮15?g為底物，加入水和異丙醇各30?mL、NAD 0.1?g，分別考察加入不對稱轉化酶EPI酶液25?mL（含固體酶0.25?g）、50?mL（含固體酶0.5?g）和75?mL（含固體酶0.75?g）時，對腎上腺酮還原反應的影響。以HPLC歸一法跟蹤反應液中R-腎上腺素的含量，確定反應終點?？疾旖Y果見表4。

根據實驗結果可知，當固體酶用量0.5?g時，即用量鹽酸腎上腺酮重量的3.3%時，可以滿足酶催化還原反應的要求，合成出高純的R-腎上腺素。

3.4 ?酶催化反應溫度的考察

按照3.3的實驗方案投料，固體酶用量為0.5?g，分別考察（20±2）℃、（30±2）℃、（40±2）℃的反應溫度對不對稱還原反應的影響。HPLC歸一化法跟蹤反應液中R-腎上腺素的含量，以確定反應平衡時間?？疾旖Y果見圖7。

根據實驗結果可知，當反應溫度為（30±2）℃時，不對稱還原反應的效果較好，反應液中R-腎上腺素的含量達99.2%。

4 ?結 論

生物酶法不對稱合成R-腎上腺素的工藝步驟中，甲胺化反應必須采取抗氧化保護措施以避免產生大量的氧化雜質，其中氮氣保護法優于加入還原劑亞硫酸氫鈉的方法。氮氣保護下2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺物料比為優選為1∶8。酶催化還原反應中催化劑EPI酶的用量優選為鹽酸腎上腺素酮重量的3.3%，最佳反應溫度為（30±2）℃。本文以生物不對稱法合成R-腎上腺素，方法可行，反應條件溫和，收率高，與傳統手性拆分法相比，縮短了工藝路線，降低了成本，適合于工業化生產。

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