響應面法優化中藥降脂復方多糖提取工藝及抗氧化研究

王婭玲 陶然 梁峰源 李佳懌 于佩琳 韓凱月 高世杰

摘 ?????要：通過響應面法優化中藥降脂復方中總多糖最佳提取工藝，計算了最佳提取條件下總多糖得率，通過體外抗氧化實驗評價其藥理作用。根據單因素實驗結果，利用超聲法優化總多糖的提取工藝，通過自由基清除率分析其抗氧化能力。結果為向1 g中藥復方粉末中加入30 mL蒸餾水，水浴超聲50 min，酸堿度為9的情況下總多糖得率最高，自由基清除率為84.93%。

關 ?鍵 ?詞：高血脂;總多糖含量;響應面優化;體外抗氧化

中圖分類號：TQ 041??????文獻標識碼：?A ?????文章編號： 1671-0460（2020）03-0555-04

Optimization?of Lipid-lowering Compound Polysaccharide Extraction

Process by Response Surface Method and Its?Antioxidant Ability

WANG Ya-ling，?TAO Ran，?LIANG Feng-yuan，?LI?Jia-yi， YU Pei-lin，?HAN Kai-yue， GAO Shi-jie

（Shandong University of traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，China）

Abstract：?By optimizing the optimal extraction process of total polysaccharide in the refaton-reducing complex of Traditional Chinese medicine by the response surface method， the total polysaccharide yield rate under the optimal extraction condition was calculated， and its pharmacological effect was evaluated by in vitro antioxidant experiments. According to the results of single-factor experiments， the extraction process of total polysaccharide was optimized by ultrasonic method， and the antioxidant capacity of free radical removal was analyzed by free radical removal rate. Results For the addition of 30 mL distilled water to 1g Chinese medicine compound powder， water bath ultrasound 50 min， acidity and alkalinity of 9 cases， the total polysaccharide yield is the highest， free radical removal rate of 84.93%.

Key words：?high blood fat; total polysaccharide content; response surface optimization;?in vitro antioxidant

研究表明，自由基過量易損傷細胞，對人體有潛在危害，因此研究抗氧化活性減少自由基的產生或加速清除研究，日益成為市場最重要的功能性訴求之一^[1]，此方為王集會教授根據多年實踐經驗總結出的新配方，多糖為方中主要有效成分之一，能清除多余自由基、促進脂質代謝^[2]、提高免疫力。

該復方包括荷葉、薏苡仁、人參、白術、當歸、大黃、山楂等中藥，涂宗財^[3]等研究表明荷葉多糖具有較好的抗氧化活性，超聲水提法與傳統熱水浸提法相比多糖得率更高;李珊珊^[4]等研究表明人參多糖能夠調節人體代謝、增強人體免疫力，臨床應用效果顯著;石娜^[5]等通過小鼠實驗表明白術多糖可以清除人體自由基，具有良好的抗氧化活性。目前人們越來越熱衷于復方配伍的研究，這幾味中藥聯合使用可增強藥效^[6]，減輕毒副作用。

根據單因素實驗結果，以最終測得總多糖得率為指標，設計三因素三水平響應面實驗確定最佳提取條件，依據各個因素的相互作用與顯著性，測定降脂復方中總多糖對體內多余的自由基清除率，初步評價其抗氧化能力，對降血脂新藥和保健品的開發提供一定的理論依據。

1 ?實驗部分

1.1 ?藥品

此方包括陳皮、荷葉、薏苡仁、靈芝等20味中藥，經實驗室自制得到干燥粉末。

1.2??試劑

苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖等。

1.3??儀器

紫外可見分光光度計;冷凍離心機^[7];移液槍;超聲清潔儀;真空抽濾泵等。

2??實驗方法

2.1??響應面實驗設計

2.1.1 ?標準曲線的繪制

參照文獻方法采用紫外可見分光光度法測定恒重葡萄糖的吸光度，?所得回歸方程為：

y?= 0.502 9x?+ 0.007?5，R² = 0.998 3

表明該中藥復方總多糖含量測定線性良好^[8]，實驗測定結果準確。

2.1.2??中藥降脂復方中總多糖含量測定

精確稱取1.0 g中藥纖體粉末，調至料液比為1∶30、pH=9，保持40 ℃不變超聲50 min，離心，抽濾，定容至100 mL， 吸取2 mL待測溶液，按“2.1.1”方法測定待測溶液總多糖含量^[9]。

2.1.3??單因素實驗

見表1，準確稱取1.0 g粉末，提取制備待測溶液，分析不同條件下超聲時間（A）、料液比（B）、pH值（C）三個因素對降脂復方中總多糖提取的影響^[10]。

2.1.4??響應面實驗

分析單因素實驗結果，考察三個影響因素及其交互作用對中藥復方中總多糖提取的影響，確定超聲輔助法提取的最佳工藝，獲取所需實驗數據^[11]。

2.2??體外抗氧化實驗

見表2，配制抗氧化實驗標準DPPH溶液，于520 nm波長下測定不同待測溶液的吸光度，結合陽性對照抗壞血酸，分析降脂復方中總多糖對DPPH自由基的清除能力。

3??實驗結果

3.1??響應面優化實驗結果

分析單因素實驗，設計響應面實驗，對三個因素進行分析，建立參數回歸模型進行方差分析，得到回歸方程：Y=53.73+0.063A+0.96B+1.67C+0.30AB+0.47AC-0.35BC-2.70A²-3.05B²-0.43C²，方差分析結果見表3。

見表4，A（超聲時間）、B（料液比）對總多糖含量測定影響不顯著，C（pH值）對總多糖含量測定影響顯著;二次項中，P值均小于0.05，A²、B²對結果影響顯著，C²對復方中總多糖得率影響不明顯^[12]，?P值大于0.05;同時，方差分析結果表明，三個影響因素兩兩之間的交互作用對多糖測定作用較小^[13]。方差分析R²=0.870?0， R_adj²=0.703?0，表明擬合度較好，實驗過程操作較為嚴謹，70.30%的實驗結果受到影響，該回歸模型可用于降脂復方總多糖提取工藝的分析與預測^[14]。

3.2??交互作用分析

響應面曲線開口朝下，說明多糖得率在0.2～0.6 mg·g^-1范圍內存在最大值。

由圖1可知，固定pH值不變，僅考慮料液比和超聲時間的影響，二者都對多糖溶出有促進作用^[15]。曲面較陡，等高線稀疏^[16]， 其交互作用干擾較小。超聲超過50 min后得率開始降低，可能原因為超聲時間為50 min時，細胞壁被超聲波破壞， 在超聲輔助下多糖充分溶解，時間過長，多糖結構受到破壞，非多糖類成分溶出，干擾多糖的提取，使總多糖得率降低。

由圖2可知，曲面較為平緩，等高線稀疏，表明pH值和料液比對多糖浸出影響不顯著，其交互作用對響應值干擾也較小，多糖浸出率受pH值的影響大于料液比的影響。多糖含量受提取溶劑的影響較大，但提取溶劑過多，其他因素的干擾作用也加大，多糖溶出受到抑制;固定超聲時間不變，僅考慮料液比和pH值的影響，在酸性條件下，pH的改變幾乎對多糖含量測定沒有影響，強堿性條件下，多糖結構破壞，使得率降低，pH=10時，多糖得率最高。

由圖3可知，雙曲面較平緩，等高線呈橢圓形，分布較為密集，表明pH值和超聲時間對復方總多糖測定的影響弱于其交互作用，多糖浸出率受pH值的影響大于超聲時間的影響，可能原因多糖被分解破壞，蛋白、黃酮等其他物質溶出。

3.3??體外抗氧化實驗

DPPH自由基清除率為評價抗氧化能力的常見指標。人體許多疾病的發生與自由基關系密切，自由基氧化反應對人體細胞具有一定的損害作用。見圖4，復方中多糖對DPPH自由基清除效果較好，在0.2～0.6?mg·mL^-1范圍內，DPPH自由基清除率呈上升趨勢，清除率與濃度呈正相關^[17]，抗氧化能力強于相同條件下的抗壞血酸，因此其抗氧化能力與稀釋度成線性相關，實際應用中可適當增加濃度來提高藥效。

4??結論

本實驗在單因素的基礎上，采用BoxBehnken法優化總多糖提取工藝，以料液比、超聲時間、pH值為因素^[18]，并在最佳條件下進行體外抗氧化實驗研究。通過響應面方差分析，研究各因素與響應值之間影響強弱并對其優化和評價。結合單因素實驗確定為向1 g中藥復方粉末中加入30 mL蒸餾水、水浴超聲50 min、酸堿度為9的情況下，此時總多糖得率為5.405%。根據F值可知， 三個因素中pH值影響最大，提取溶劑的用量次之，超聲時間影響最小。體外藥理實驗表明^[19]，降脂復方中DPPH自由基清除率為84.93%，具有顯著的抗氧化活性，為開發高效降脂藥物提供一定的實驗基礎。

研究表明植物多糖具有顯著降低血脂含量的作用，可調節免疫代謝、保護心腦血管，在治療高脂癥方面應用前景廣闊。中藥降脂復方可調節脂質代謝紊亂^[20]、減少脂質的吸收，因其效果顯著，用藥安全，吸引越來越多的學者熱衷于中藥調節血脂的研究^[21]。復方中百合、山藥、山楂、薏苡仁等中藥既有藥用價值，也有營養價值^[22]。在日常生活中，可以作為食物長期使用從而達到養生保健、降低血脂的作用^[23]， 促使中藥食品化、現代化。

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