卵巢漿液性癌組織中起始因子EIF5A2和基質(zhì)金屬蛋白酶-21的表達(dá)及臨床意義*

王 莉

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科(錦州 121000)

卵巢漿液性癌好發(fā)于中老年人，近年觀點(diǎn)認(rèn)為其起源于輸卵管的腺上皮細(xì)胞，病變形成后進(jìn)展快，易于播散，尤其是高級(jí)別的病變[1]。真核翻譯起始因子家族是近年關(guān)注的與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子，在腫瘤進(jìn)展中有重要作用。真核翻譯起始因子5A2(Eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2)是家族中的重要成員，能有效激活聚尿苷mRNA，與腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[2]。近年研究顯示EIF5A2對(duì)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix met alloproteinases,MMPs)的表達(dá)有一定作用。基質(zhì)金屬蛋白酶-21(Matrix metalloprotein-21,MMP-21)是家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用較強(qiáng)，可引起腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)重塑，使可溶性細(xì)胞因子分泌增多，加速腫瘤細(xì)胞的遷移。也有研究認(rèn)為MMP-21在細(xì)胞外基質(zhì)的活化和癌性間質(zhì)的形成中有重要作用[3]。本研究檢測(cè)EIF5A2和MMP-21在卵巢漿液性癌中的表達(dá)，分析其臨床意義，關(guān)注其與增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的相關(guān)性。

資料和方法

1 一般資料 選擇2013年 1月至2014年11月在我院確診并行手術(shù)治療的卵巢漿液性癌患者作為觀察組，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，由病理醫(yī)師再次復(fù)核；②原發(fā)腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷有異議者；②術(shù)前行放、化療者。共觀察79例，年齡36～87歲，平均(61.2±11.7)歲。選擇同期在我院確診為卵巢漿液性囊腺瘤并行手術(shù)治療的患者作為對(duì)照組，共79例，年齡32～80歲，平均(59.2±10.3)歲。均留取術(shù)后新鮮標(biāo)本(-80℃冰箱凍存)和石蠟包埋標(biāo)本。兩組在常規(guī)資料的比較中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2．1 EIF5A2和MMP-21的檢測(cè)：應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)兩組中EIF5A2和MMP-21的表達(dá)。檢測(cè)基于石蠟包埋組織。EIF5A2和MMP-21均為濃縮液，購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司。先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取效果最理想的濃度(EIF5A2為1∶300、MMP-21為1∶100)進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，行DAB顯色，做好質(zhì)控工作。EIF5A2和MMP-21的陽(yáng)性部位均為細(xì)胞質(zhì)，以棕黃色為陽(yáng)性。以無、弱、中、強(qiáng)著色分別計(jì)為0、1、2、3分。選擇5個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)算陽(yáng)性率，以<5%、5%～10%、11%～30%、31%～50%、≥50%為別計(jì)為0、1、2、3、4分。二者評(píng)分相乘為總分，總分范圍為0～12分，以≤4分陰性，>4分陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性率。

2．2 PCNA的檢測(cè)：應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)觀察組術(shù)后組織中PCNA的表達(dá)。檢測(cè)基于新鮮凍存組織，內(nèi)參應(yīng)用GAPDH。首先提取總蛋白，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜的方法轉(zhuǎn)到PVDF膜，應(yīng)用牛奶進(jìn)行封閉，加入一抗，4℃過夜后加入二抗，并孵育2 h，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影，拍照。采用Image J軟件進(jìn)行分析，以蛋白與GAPDH的比值進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，率的比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，并應(yīng)用Spearman相關(guān)分析、K-M生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組中EIF5A2和MMP-21表達(dá)的比較 兩組中EIF5A2和MMP-21的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖1。

表1兩組中EIF5A2和MMP-21陽(yáng)性率比較[例(%)]

A：EIF5A2在卵巢漿液性囊腺瘤陰性表達(dá)；B：MMP-21在卵巢漿液性囊腺瘤中陰性表達(dá)；C：EIF5A2在卵巢漿液性癌中陽(yáng)性表達(dá)；D：MMP-21在卵巢漿液性癌中陽(yáng)性表達(dá)

圖1 EIF5A2和MMP-21的表達(dá)(IHC ×200)

2 觀察組不同臨床病理特征中EIF5A2和MMP-21陽(yáng)性率的比較 觀察組中EIF5A2和MMP-21的陽(yáng)性率在不同脈管累犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤最大徑的分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在不同年齡、病理分級(jí)和神經(jīng)累犯的分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 觀察組中EIF5A2和MMP-21的相關(guān)性 觀察組中EIF5A2和MMP-21的表達(dá)行Spearman相關(guān)分析，顯示兩者具有正相關(guān)性(r=0.49，P=0.041)。

4 觀察組中EIF5A2、MMP-21與PCNA的相關(guān)性 應(yīng)用Western Blot檢測(cè)觀察組中PCNA的表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)量為0.8～3.6，平均為(2.1±0.5)。Spearman相關(guān)分析顯示EIF5A2與PCNA(r=0.54，P=0.022)、MMP-21與PCNA(r=0.56，P=0.013)均呈正相關(guān)性。

5 觀察組中EIF5A2和MMP-21表達(dá)的生存分析 觀察組患者均行術(shù)后5年(60個(gè)月)生存時(shí)間的隨訪，其中死亡61例，存活15例，失訪3例，死亡患者術(shù)后生存時(shí)間為6～60個(gè)月，中位時(shí)間21個(gè)月。經(jīng)K-M生存分析顯示，EIF5A2(χ2=5.31，P=0.021)和MMP-21(χ2=6.32，P=0.009)的表達(dá)均與生存時(shí)間相關(guān)。見圖2。

表2觀察組不同臨床病理特征中EIF5A2和MMP-21陽(yáng)性率的比較[例(%)]

圖2 EIF5A2和MMP-21表達(dá)的生存分析

討 論

卵巢漿液性癌發(fā)展快，由于部位的特殊性，發(fā)現(xiàn)較為困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤體積常較大，生長(zhǎng)迅速，腫瘤中可見明顯的出血、壞死[4]。病變表現(xiàn)為明顯的侵襲性，尤其是高級(jí)別腫瘤，在首發(fā)時(shí)可觀察到腹膜、子宮、闌尾及對(duì)側(cè)卵巢的累犯。遺傳學(xué)改變對(duì)病變形成和進(jìn)展有重要作用[5]。EIF5A2是近年發(fā)現(xiàn)的與增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，被TIF51B基因所編碼，在代謝和翻譯調(diào)控方面有一定作用。EIF5A2具有高度的保守序列，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、翻譯及mRNA的轉(zhuǎn)錄有重要的調(diào)控作用。陳杰偉等[6]通過觀察EIF5A2在食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EIF5A2在腫瘤組織中的表達(dá)增高，認(rèn)為其參與了腫瘤的形成，并促進(jìn)腫瘤的侵襲。EIF5A2是促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因子，這種作用使腺上皮細(xì)胞失去了上皮的特征，如粘附性和極性，并使腫瘤外圍細(xì)胞具有間質(zhì)的特性，其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，表現(xiàn)出較高的侵襲能力和抗凋亡作用[7]。而MMP-21也是與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，是機(jī)體中重要的基質(zhì)水解酶，對(duì)降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白、層粘連蛋白的作用最強(qiáng)[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示卵巢漿液性癌中EIF5A2和MMP-21的表達(dá)明顯高于漿液性囊腺瘤，提示EIF5A2和MMP-21對(duì)促進(jìn)腫瘤形成有一定價(jià)值，EIF5A2和MMP-21高表達(dá)是腫瘤形成的重要分子事件。結(jié)果顯示觀察組中EIF5A2和MMP-21的表達(dá)在不同脈管累犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤最大徑的分組中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EIF5A2和MMP-21高表達(dá)參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。EIF5A2和MMP-21高表達(dá)時(shí)預(yù)示腫瘤具有高增殖狀態(tài)及較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，通過EIF5A2、MMP-21與PCNA的相關(guān)性得到證實(shí)。EIF5A2對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯有重要的促進(jìn)功能，并能調(diào)控核質(zhì)運(yùn)輸，對(duì)細(xì)胞質(zhì)的翻譯作用突出。EIF5A2是腫瘤細(xì)胞合成中蛋白合成的調(diào)控因子，能引起細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。EIF5A2在發(fā)揮功能時(shí)也常受很多因素的影響，如缺氧、應(yīng)激反應(yīng)等[2]。EIF5A2對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用也是促進(jìn)病變進(jìn)展的重要因子。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)EIF5A2和MMP-21的表達(dá)與神經(jīng)累犯的關(guān)聯(lián)性，提示二者對(duì)噬神經(jīng)生長(zhǎng)無明顯作用。本研究發(fā)現(xiàn)EIF5A2和MMP-21具有正相關(guān)性，提示二者具有協(xié)同作用，EIF5A2可能是上游基因，對(duì)MMP-21的產(chǎn)生起一定調(diào)控作用。EIF5A2在腫瘤中分泌增多，引起MMP-21高表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移[9]。此時(shí)包括MMP-21在內(nèi)的MMPs家族中的多個(gè)成員表達(dá)均升高，降解基底膜等腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，為腫瘤遷移提供了更直捷的通路[10-12]。EIF5A2在病變進(jìn)展時(shí)使微管蛋白的結(jié)構(gòu)和組裝形式發(fā)生變化，使腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定性發(fā)生改變[13-15]。此種作用機(jī)制與EIF5A2激活聚尿苷mRNA的翻譯功能可能有關(guān)。二者協(xié)同作用的方式及原理尚需要更多研究證實(shí)。結(jié)果顯示EIF5A2和MMP-21的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，提示EIF5A2和MMP-21高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后，這為臨床判斷預(yù)后提供了可能的客觀指標(biāo)，但是需要后續(xù)研究進(jìn)行大樣本、多中心、多因素的分析后明確。

綜上所述，EIF5A2和MMP-21高表達(dá)且具有正相關(guān)性是卵巢漿液性癌重要的分子事件，二者可能對(duì)腫瘤的增殖有一定的調(diào)節(jié)，聯(lián)合檢測(cè)二者的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)。