光周期對許氏平鲉性腺分化過程中形態學、性激素水平及相關基因表達的影響

呂里康 張思敏 李吉方 溫海深

(中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

魚類性別決定與分化除了遺傳型性別決定(Genetic Sex Determination, GSD)外, 還存在環境型性別決定(Environmental Sex Determination, ESD),以及遺傳+環境型性別決定[1]。影響魚類性別分化的環境因子主要包括溫度、光周期、pH、鹽度、種群密度等[2]。溫度是影響魚類性腺分化的一種重要環境因素。除了溫度外, 光周期也能夠影響魚類的性腺分化, 稱為光周期依賴型性別決定(Photoperiod-dependent sex determination, PSD)。Brown等[1]研究表明, 在加利福尼亞銀漢魚(Leuresthes tenuis)的性腺分化時期, 長光照(L∶D=15∶9)下性腺分化偏雌性發育, 短光照(L∶D=12∶12)下偏雄性發育。盡管光周期對魚類的性腺分化有一定的影響,但目前在光周期影響魚類性腺分化這方面的報道較少, 大部分關注的是光周期對魚類性腺發育和成熟, 比如: 月銀漢魚(Menidia beryllina)[3]、金魚(Carassius auratus)[4]等。

魚類性別決定和性腺分化相關基因的研究主要集中在cyp19a、sox9、dmrt1上,ERα、ERβ2等核受體基因, 以及foxl2、sox3和amh等基因的相關報道也逐漸增多。例如在日本鰻鱺(Anguilla japonica)的性腺分化時期cyp19a1a基因的表達量顯著增加[5]。在對金錢魚(Scatophagus argus)的研究可見雌激素受體在精巢和卵巢發育中都具有重要的作用[6]。同時魚類的性別分化也與內分泌系統有著密切的聯系。環境因素對魚類性腺分化及發育的調控主要是各種性類固醇激素通過下丘腦-垂體-性腺軸實現的[7], 這些性類固醇包括雌二醇(Estradiol,E2)、睪酮(Testosterone, T)和11-酮基睪酮(Ketotestosterone, 11-KT)等。

許氏平鲉(Sebastes schlegelii)屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes), 俗稱“黑頭”、“黑石鱸”等, 是一種分布在西北太平洋近海巖礁底棲卵胎生硬骨魚魚類。其肉質鮮美, 營養豐富, 生長快速且抗病能力強, 已成為我國北方沿海人工養殖的重要品種之一。其產仔期間正值4—6月, 晝夜時長變化劇烈, 發育階段仔稚魚會隨著發育向水底下沉。目前對許氏平鲉性腺分化相關研究較少, 本實驗室已對其性腺分化模式及溫度影響下性腺分化情況展開了相關研究(未發表數據)。本研究在這一時期進行不同光周期處理實驗, 探究光周期對許氏平鲉性腺分化的影響。通過組織學切片技術觀察許氏平鲉仔魚性腺分化與發育情況, 通過測定性類固醇激素水平和性別分化相關基因的表達情況, 探究不同光周期對性腺分化影響中的潛在機制。同時為光周期對卵胎生魚類性腺分化的影響提供一定的資料和依據, 并對許氏平鲉養殖生產提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗所用仔稚魚于2016年5月采至山東省青島市貝寶有限責任公司養殖群體, 養殖環境水溫14—19℃, 鹽度(29±1)‰。在自然條件下養殖, 30 dpb(day post birth)后挑選體質健康, 發育良好的仔稚魚[體長 (1.190±0.028) cm, 體質量(0.032±0.001) g]轉至實驗室循環水養殖系統養殖, 共布3個玻璃缸(40 cm×40 cm×40 cm), 水溫19—22℃, 鹽度30‰, 養殖密度為2尾/L。

1.2 實驗設計及樣品采集

從30 dpb時開始, 暫養4d, 35 dpb開始正式實驗。設置3組, 分別為: 短光照組(L∶D=8∶16, 光照時間為7:00—15:00)、長光照組(L∶D=16∶8, 光照時間為7:00—23:00)和對照組(L∶D=12∶12, 光照時間為7:00—19:00), 因在室內循環水養殖系統中進行實驗, 所有光照條件均為8.5 W節能燈補充, 其他條件不變。每日8:00和15:00投喂鹵蟲無節幼體, 實驗第10天添加配合飼料。

根據本實驗室未發布研究結果顯示, 卵巢在35 dpb左右開始出現分化, 精巢分化時間較晚, 在60—65 dpb左右, 70 dpb出現明顯的精原細胞和輸精管, 故本實驗從35 dpb為開始實驗的第1天, 實驗到第21天為止。從1d起, 每3天采1次樣, 隨機取2—3尾許氏平鲉仔稚魚樣品于Bouin固定液中保存;取8尾許氏平鲉仔稚魚樣品在液氮中快速冷凍, 于-80℃保存備用。

1.3 石蠟組織切片及觀察

許氏平鲉仔稚魚全魚經過Bouin固定液固定24h后, 經梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 浸蠟, 石蠟包埋, 待石蠟凝固后修整蠟塊, 全魚連續縱切, 切片厚度為7 μm, 展片, 38℃烘箱烘干, 進行蘇木精-伊紅染色(H.E染色), 中性樹脂封片, 晾干。在顯微鏡下觀察拍照, 并統計性別比例。

1.4 許氏平鲉仔稚魚雌二醇(E2)和睪酮(T)含量的測定

因稚魚規格太小, 無法抽取血液, 故使用未去除內臟團的全魚組織勻漿進行激素測定。每1尾魚為一個樣本, 1個時期3個生物學重復, 共3尾魚。制備全魚組織勻漿, 采用碘I125雌二醇放射免疫分析試劑盒(九鼎, 天津)及RIA液相平衡競爭放射性免疫分析法測定E2和T的水平, 參考Shi等[8]的方法。

1.5 許氏平鲉仔稚魚性別分化相關基因表達分析

運用Trizol法按照相應的步驟提取全魚總RNA, 每個時期3尾, 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, 日本)去除基因組DNA并反轉錄成cDNA。

cyp19a1a(FJ594995.2)、ERβ2(HQ452829.1)、foxl2(JN998083.1)和βactin(KF430616.1)基因序列來源于GenBank,ERα、sox9、amh、sox3和dmrt1的基因序列均來源于許氏平鲉轉錄組數據(登錄號:SRR4409372)。實驗中所用的特異性引物用Primer Premier 5.0軟件設計(表 1)。

采用SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa, 日本)在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(Applied Biosystems, 美國)上進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測性腺分化相關基因表達量, 每個時期5尾魚的cDNA(500 ng/μL)等體積混為一個樣本。實驗的反應體系及上機程序見本實驗室已發表文章[9]。以β-actin為內參基因, 根據2－ΔΔCt法計算得到許氏平鲉性腺分化相關基因mRNA的相對表達量。

1.6 數據處理

使用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析(ANOVA), 探究許氏平鲉稚魚不同發育階段以及不同光周期下各數據的差異顯著性, 在假定方差齊性的條件下, 作Tukey-HSD多重比較分析(若不滿足方差齊性, 采用Games-Howell法)。所得數據均用平均值±標準誤(Mean ± SE)表示。

2 結果

2.1 不同光周期對許氏平鲉性腺發育及分化的影響

根據本研究室前期研究結果, 35 dpb左右稚魚性腺開始分化, 并且卵巢先分化。一部分性腺出現小的裂隙, 可能發育為卵巢腔, 性腺雙葉大小差別明顯, 這類性腺一般發育為卵巢; 另外一部分性腺雙葉大小差別不明顯, 性腺中無裂隙出現, 這類性腺一般發育為精巢(未發表數據)。

處理第0天, 許氏平鲉性腺分化已開始, 根據對全魚組織學切片分析(圖 1), 卵巢發育程度為長光照組發育最快, 短光照組最慢。該時期卵巢中有血管的深入和卵巢腔的出現, 在短光照組中, 卵巢體積較小, 卵巢腔的裂隙較小, 而對照組與長光照組卵巢腔裂隙較大, 微血管明顯, 卵巢體積相對較大,其中長光照組卵巢體積最大。而2個處理組中精巢均呈梨形或橢圓形, 性腺雙葉大小差別不明顯, 精巢發育程度差別不明顯。統計性別比例結果為短光照組、對照組和長光照組的雌雄比均為1∶1。

處理21d后(圖 2), 卵巢的發育程度為對照組最快, 短光照組發育最慢, 對照組中卵巢體積最大, 卵巢腔發育較為完整, 并可見數個卵母細胞; 短光照組和長光照組的卵巢腔裂隙較小, 卵巢體積最小。精巢的發育程度為對照組和短光照組大于長光照組, 對照組精巢中出現輸精管, 短光照組精巢中可觀察到數個精原細胞, 精巢分化開始, 對照組和短光照組中的精巢體積均較長光照組中的大, 長光照組中未出現輸精管或精原細胞的出現, 體積較小,呈梨形(圖 2)。統計性別比例結果為: 短光照組和長光照組雌雄比無變化, 均為1∶1, 對照組雌性率升高, 達到66.7%, 說明光周期為L∶D=12∶12時, 性腺分化偏雌性發育。

綜合分析性腺發育程度和性別比例, 可以看出非自然光周期(短光照和長光照)均會影響性腺分化, 可能導致了性腺發育速度減慢, 同時通過對長光照和短光照樣品組織學比較發現在性腺發育受影響的情況下, 短光照中精巢發育較長光照快, 說明短光照可能會導致部分性腺雄性化。

2.2 不同光周期對許氏平鲉性類固醇激素水平的影響

如圖 3A所示, 在對照組中, 實驗0—6d無顯著性變化, 9d時, E2水平顯著上升至最大值(P＜0.05),12d時E2水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩; 在短光照組中, 實驗第3天E2水平顯著上升(P＜0.05),3—15d E2水平基本處于較高水平, 18d后顯著下降為(P＜0.05), 之后趨于平穩; 長光照組處理0—3d無顯著性變化, 6d時, E2水平顯著上升(P＜0.05)后開始下降, 至12d時E2水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩。可見在實驗整個階段中, E2水平波動基本出現在0—18d。并且在短光照中, E2水平更早出現峰值。

如圖 3B所示, 對照組0—6d時, T的含量處于較低水平, 9d時, T水平顯著上升至最大值(P＜0.05),12d時T水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩; 短光照組0—6d, T水平逐漸降低(P＜0.05), 到第9天開始上升并維持至15d之間, T水平基本處于較高水平, 至18d的T水平顯著下降(P＜0.05), 之后趨于平穩; 長光照組第3天T水平顯著下降, 第6天時顯著上升至最大值(P＜0.05), 并在12d之前含量一直維持在較高水平, 第15天時開始顯著下降(P＜0.05),之后趨于平穩。在整個實驗周期中, T水平在3個處理中均在9d時達到峰值, 到18—21d, 各組之間趨于穩定。

表 1 基因表達分析的特異性引物Tab. 1 Primer sequences for mRNA expression analysis

2.3 光周期對許氏平鲉性腺分化相關基因表達水平的影響

如圖 4所示,cyp19a1a在短光照組第1天時開始顯著下降(P＜0.05), 第9天時進一步顯著下降(P＜0.05), 之后水平基本保持不變; 對照組中從第6天逐漸下降至接近0, 之后處于極低水平, 21d時有所上升, 但仍處于較低水平; 長光照組9d之后處于極低水平, 21d時有所上升, 但仍處于較低水平。可見cyp19a1a在實驗第6天均出現下降趨勢, 并在后期處于較低的穩定期, 不同處理之間無明顯差異。ERα的相對表達水平在短光照組的波動類似cyp19a1a, 呈波動下降趨勢, 從第3天開始下降, 在15d時出現一個較小的峰值, 然后趨于穩定; 對照組和長光照組均呈先上升后下降的趨勢, 對照組中1—12d逐漸上升至峰值后逐漸下降, 長光照中1—9d逐漸上升峰值后有所下降, 但整體處于較高水平。可見在3個處理組中, 短光照組的ERα在中后期表達受到了明顯的抑制。ERβ2的相對表達水平在短光照組第6天時顯著上升但在9d時迅速顯著下降(P＜0.05), 之后均處于極低水平, 21d時有所上升;對照組和長光照組均呈穩定下降的趨勢, 并在9d后趨近于0。類似于ERα, 短光照組對ERβ2表達模式有同樣的影響。foxl2的相對表達水平在短光照組6d時顯著上升并在9d時顯著下降至極低水平, 之后有輕微上升趨勢; 對照組和長光照組均呈先下降后趨于平穩再上升的趨勢。在對照組中第6天后逐漸下降并在之后處于極低水平, 21d時有所上升; 而在長光照組中第9天逐漸下降并在之后處于極低水平,21d時有所上升。由此可見相對短光照處理, 長光照處理對foxl2的表達未見影響。

圖 1 不同光周期下第0天許氏平鲉的性腺組織切片Fig. 1 The gonads histologic section of Sebastes schlegelii at day 0 under the different photoperiod conditions

如圖 5所示,sox3的相對表達水平在短光照組3—6d顯著上升至最大然后在第9天時開始下降,18d時顯著上升至較高水平(P＜0.05)然后在21d時開始下降; 對照組處理階段在21d之前sox3均處于較低水平, 21d時顯著上升(P＜0.05); 在長光照組中第6天和18d處于較高水平, 其他時期均處于較低水平。sox9的相對表達水平在短光照組1—6d逐漸上升但在第9天顯著下降至較低水平(P＜0.05), 第21天逐漸上升; 對照組在1—6d逐漸下降后趨于穩定,21d時顯著上升(P＜0.05); 長光照組在6d后逐漸下降后保持在較低水平。sox9的表達模式在長光照組中并未受影響, 但在短光照處理下出現不同的表達模式, 尤其是在6d前顯著上升。amh的表達水平在短光照組中從第3天時顯著下降(P＜0.05), 之后保持在較低水平; 對照組在1—6d逐漸下降之后基本不變, 但在18d時顯著上升(P＜0.05); 長光照組總體呈上升趨勢, 21d上升至最大值。不同的光照對amh的表達模式影響顯著, 短光照抑制其表達, 長光照則相反。dmrt1的表達水平在短光照組中除了第6d外,其他時期均處于較低水平; 對照組中15d之前基本處于較低水平, 15d時顯著上升(P＜0.05), 之后逐漸下降; 長光照組中除了第6和第15天外, 其他時期均處于較低水平, 其中15d時達到最大值。

圖 2 不同光周期下第21天許氏平鲉的性腺組織切片Fig. 2 The gonads histologic section of Sebastes schlegelii at day 21 under the different photoperiod conditions

3 討論

3.1 光周期對許氏平鲉性腺分化的影響

魚類生殖受多種因素影響, 在中高緯度季節變化中, 光周期對其影響尤其大[10]。本實驗室未發表結果顯示, 本實驗開始時(30 dpb)性腺已開始分化。本實驗處理21d時, 對照組的卵巢發育速度最快, 其次是長光照組, 短光照組最慢, 對照組和短光照組精巢的發育速度差異不明顯, 但快于長光照組,短光照組和長光照組雌雄比無變化, 對照組雌雄比升高, 光周期為L∶D=12∶12時, 性腺分化偏雌性發育。綜合分析本實驗結果性腺發育程度和性別比例, 可以看出非自然的光周期尤其是較短的光照,均會不同程度地影響性腺分化時期性腺發育程度;并且短光照會導致部分性腺雄性化。在加利福尼亞銀漢魚的性腺分化時期, 長光照(L∶D=15∶9)處理下性腺分化偏雌性發育, 短光照(L∶D=12∶12)處理下偏雄性發育[1], 這與本研究的結果有所不同。從性腺發育速度來看, 在本研究中卵巢與精巢對光周期的響應相反, 對照組中卵巢和精巢發育均較快。在松江鱸(Trachidermis fasciatus)[11]生長和性腺發育的關鍵時期, 長光照14h較自然光照周期有利于促進松江鱸的性腺發育, 長光照組的卵巢較自然光對照組發育更快。月銀漢魚[3]、金魚[4]等性腺發育研究表明, 光照時間越長發育成熟速度越快, 但對大西洋鮭(Salmo salar)的研究結果相反[12]。因此,這說明在同一光照周期下, 不同物種的性腺分化和發育速度對光照周期的應答和敏感程度不同。

3.2 光周期對許氏平鲉全魚性類固醇激素水平的影響

光照周期在硬骨魚類性腺分化、發育和成熟等過程中起著重要的作用, 主要是各種性激素通過下丘腦-垂體-性腺軸實現調控的[7], 其中包括E2、T、11-KT等。Frisch[13]的研究表明, E2和11-KT在魚類性別改變中也起著重要的作用, 而T不能直接影響性別的改變, 但是可以間接地通過影響其他激素(如E2)的合成來影響性別改變。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)性腺分化中, 尤其是卵巢分化中, 雌激素的合成起著重要的作用[14]。在本研究中, 在3組不同光周期處理下第9天時, E2和T均達到較高水平, 12d時對照組E2和T水平下降到較低水平, 而長光照組E2和T水平下降到較低水平是在12d和15d, 短光照組E2和T在18d時才下降到較低水平。結合組織切片結果可知, 性腺分化過程中的前期E2和T處于較高水平, 之后下降到較低水平。因此, 對照組卵巢發育最快, 短光照組的精巢發育較快, 可能是由于T的含量處于較高水平時間較長所導致。綜合來說, 光周期為L∶D=12∶12時有利于許氏平鲉的性腺分化,但不同的物種E2和T對光周期的應答不同, 比如對半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[15]的研究中光周期對T和E2的影響不顯著; 在對虹鱒[16]的研究中, 增加光照周期, E2和T含量增高, 在短光照下, 2種激素含量上升更快, 證明短光照刺激使E2和T含量升高,短光照對虹鱒性腺成熟發育非常重要。

圖 3 不同光周期對許氏平鲉仔稚魚E2(A)、T(B)水平的影響Fig. 3 Effects of the E2 (A) and T (B) level of Sebastes schlegelii larvae under different photoperiod condition

3.3 光周期對許氏平鲉性腺分化相關基因表達水平的影響

目前, 大多數對硬骨魚類性別分化相關基因的研究表明, 與性腺分化相關的基因主要有dmrt基因家族、cyp11a1基因、sox基因家族、核受體基因(雌激素受體和雄激素受體)、amh基因和foxl2基因等[17]。其中cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2基因與卵巢的分化密切相關, 在卵巢分化中起著重要的調控作用; 而sox3、sox9、amh和dmrt1基因與精巢的分化相關, 但sox3基因在一些魚類的卵巢分化也起著一定的作用[18]。外界環境通過這些基因來調控性腺分化和發育等過程。

圖 4 不同光周期下許氏平鲉卵巢分化相關基因mRNA相對表達水平(A、B、C和D分別為cyp19a1a、 ERα、ERβ2和foxl2 mRNA相對表達水平)Fig. 4 The relative mRNA expression level of ovary differentiation related genes in Sebastes schlegelii under different photoperiod condition (A, B, C and D showed the relative mRNA expression level of cyp19a1a, ERα, ERβ2 and foxl2, respectively)

cyp19a1a是介導雄激素向雌激素轉化的關鍵酶基因, 被認為是一個魚類卵巢分化的早期標志,并且在性腺分化過程中有重要作用[19]。研究表明,cyp19a1a基因只在卵巢中表達, 在精巢中基本上沒有表達, 并且其表達水平及活性與雌激素的合成緊密相連[18]。在暗紋東方鲀(Takifugu obscures)[20]性腺分化期間用芳香化酶抑制劑處理仔魚, 雌魚cyp19a基因表達被顯著抑制, 原始卵巢退化, 并向功能性精巢發育。在本研究中, 實驗第1天(35 dpb)時性腺已開始分化, 在3組實驗中cyp19a1a的表達量均逐漸下降, 之后穩定在較低水平。在開始時3組的cyp19a1a的表達量處于較高水平, 可能是由于此時是卵巢分化時期, 21d時均已降低到最低水平, 但長光照組表達量相對較高。結合組織切片初步推斷, 性腺分化時期光周期為L∶D=12∶12時, 性腺分化偏雌性發育, 較長的光照時間可能導致卵巢發育速度加快, 短光照可能使精巢分化速度加快。

圖 5 不同光周期下許氏平鲉精巢分化相關基因mRNA相對表達水平(A、B、C和D分別為sox3、sox9、amh和dmrt1 mRNA的相對表達水平)Fig. 5 The relative mRNA expression level of testis differentiation related genes in Sebastes schlegelii under different photoperiod condition (A, B, C and D showed the relative mRNA expression level of sox3, sox9, amh and dmrt1, respectively)

在魚類中ER包含3種類型, 分別為ERα、ERβ1和ERβ2, 參與魚類的性別分化等生理過程[21]。有研究表明, 核受體也可以調控芳香化酶[22]。在本研究中,ERβ2、foxl2和cyp19a1a的表達水平的總趨勢基本一致,ERβ2的表達可能也和cyp19a1a的表達有關。21d時, 在短光照組中ERβ2的表達顯著上升, 說明ERβ2可能在精巢的分化中也起一定的作用。在金錢魚[6]的研究表明, 雌激素受體可能在精巢和卵巢發育中都具有重要的作用。在甲狀腺激素誘導斑馬魚(Danio rerio)[23]雄性化的研究中, 性腺分化期間,esr1、esr2a和esr2b的表達水平下降。而在本研究中ERα與ERβ2、foxl2和cyp19a1a的表達模式不同, 在短光照組中, 除了第1天處于較高水平, 之后一直處于較低水平, 長光照組的ERα表達水平基本比其他兩組都高, 對照組次之。這說明短光照可能抑制了ERα的表達, 長光照可能會促進ERα的表達, 但在性腺分化中起的作用并不大。

foxl2基因是目前發現的最早的脊椎動物卵巢分化的標志性啟動基因, 對卵巢芳香化酶和卵巢分化起重要作用[17]。foxl2在烏鱧(Channa argus)[24]早期性腺分化中起重要作用, 在1—11日齡表達顯著上調, 27日齡時在卵巢中表達量升高。有研究表達明,foxl2參與cyp19a1a的上游調節,foxl2和cyp19a1a的表達具有顯著的正相關關系[25]。在本研究中,foxl2表達水平總趨勢與cyp19a1a的一致, 開始時處于較高水平可能是由于此時期為卵巢分化時期, 精巢未分化, 隨著卵巢的逐漸發育,foxl2和cyp19a1a的表達逐漸降低, 最后穩定在較低水平。在短光照處理的第6天,foxl2的相對表達水平突然上升, 可能是由于樣品的原因, 具體仍需進一步研究。光周期為L∶D=12∶12在21d時foxl2相對表達水平較其他兩組顯著上升, 這與組織切片結果一致, 進一步說明非自然光照有可能影響性腺的發育和分化。

sox3和sox9均屬于sox基因家族, 與SYR基因序列有較高的相似性, 并在性腺分化中起著重要的作用。dmrt1基因是dmrt基因家族中的一員, 該基因被認為是性別分化基因, 與雌雄性別發育相關[17,26]。Sutton等[27]的研究表明, 特殊品系的小鼠中sox3基因通過介導sox9表達上調的途徑誘導精巢的分化。常重杰等[28]研究發現, 大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)的sox9基因的表達水平在精巢中顯著較高, 可能精巢分化與形成有一定的關系。在本研究中,sox3、sox9和dmrt1基因的表達水平變化總趨勢基本一致, 也可能是由于sox9基因是sox3和dmrt1基因上游調節基因, 調節sox3和dmrt1的轉錄表達。sox3、sox9和dmrt1基因在實驗后期表達量逐漸升高可能與精巢分化較晚有關。結合組織切片結果, 短光照組的sox9和dmrt1的表達水平顯著上升可能與精巢的分化有關, 進一步說明, 短光照有利于精巢的分化。

目前對amh基因的研究表明, 雖然在硬骨魚類中沒有繆勒氏管的存在, 但在其性腺中也檢測到了amh, 這說明amh可能在魚類性腺分化和雄性性腺的維持中起一定的作用[29]。在斑馬魚[30]性腺分化中,amh的表達呈性別二態性, 在31日齡的幼魚的精巢中amh較高。在本實驗后期amh的相對表達水平逐漸升高, 這可能與精巢的后分化有關。但在21d時,amh與sox3、sox9和dmrt1基因的表達模式不同, 在長光照下amh的表達顯著上升, 隨著光照時間的增長amh的表達水平逐漸上升, 初步推測,amh可能與卵巢分化有一定的關系。

本研究通過對許氏平鲉30 dph的仔稚魚進行不同光周期處理, 對其性腺分化及發育情況進行探索,發現非自然的光周期尤其是較短的光照, 均會不同程度地影響性腺分化時期性腺發育程度, 并且短光照會導致部分性腺雄性化; E2水平在非自然光周期影響尤其是在短光照下更早出現峰值, 而T在不同處理下水平均較高; 4個卵巢分化相關基因cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2的相對表達水平在短光照處理下均受到抑制, 聯系組織切片結果可發現, 短光照在一定層面上影響卵巢的發育, 導致性腺雄性化;4個精巢分化相關基因sox3、sox9、amh和dmrt1的相對表達水平未見明顯規律, 可能與精巢分化時間較晚有關。綜合而言, 較短的光照會影響性腺的發育以及性腺的分化, 抑制卵巢分化基因的表達, 誘導原始性腺雄性化。