牙鲆甲狀腺激素受體TRαA介導甲狀腺激素調控的靶基因鑒定

謝 燕 付元帥 施志儀 季文瑤 陶家康

(上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

牙鲆Paralichthys olivaceusTemminck & Schlegel屬于鰈形目, 在仔魚向稚魚的胚后發育中經歷劇烈的變態過程, 表現為右眼左移、體位從側臥變為平臥、浮游轉為底棲生活等。甲狀腺激素(Thyroid Hormone, TH)在鰈形目魚類變態過程中起著關鍵性的調控作用[1—3], 直接控制著仔魚變態的進程。T3(3, 3′, 5-triiodo-L-thyronine,三碘甲狀腺原氨酸)是TH發揮生理作用的主要形式。TH是通過甲狀腺激素受體(Thyroid Hormone Receptors, TRs)和非甲狀腺激素受體發揮作用[4,5]。甲狀腺激素受體屬于核受體超家族中的一員, 是配體T3誘導的轉錄因子, 在介導T3的作用過程中處于核心地位, 通過招募多種共激活子或共抑制子來實現基因轉錄的激活或抑制。TRs分子在結構上分為6個區, 從氨基端到羧基端依次為A-F區, 組成3個功能域: 轉錄激活域AF-1(A/B區), DNA結合域DBD(C區), 鉸鏈區(D區), 配體結合域LBD(E區)[6,7]。TRs與維甲酸X受體(Retinoid X receptors)及其他核受體形成異二聚體結合到靶基因啟動子區域的甲狀腺激素應答元件上(Thyroid Hormone Response Elements,TREs), 從而調控靶基因轉錄[8,9]。TREs通常包含兩個或更多個串聯排列的六聚體半位序列AGGT(C/A)A[10], 具有3種識別類型[11]: 回文結構(Palindrome, AGGTCATGACCT, 如生長激素Ⅰ即Gh1)、直接重復(Direct Repeat, 最常見DR4類型, AGGTCANNNNAGGTCA, 如kruppel-like因子9即Klf9)和倒置回文結構(Everted Repeat, 最常見6 bp間隔,TGACCTNNNNNNAGGTCA, 如髓磷脂堿性蛋白即myelin basic protein, Mbp)。牙鲆含有TRαA、TRαB和TRβ三種受體, TR亞型(TRαA、TRαB和TRβ1、TRβ2)在牙鲆變態期間基因表達具有時間特異性和組織特異性:TRαA在變態高峰期急劇增加,高峰期后又迅速下降;TRαB在仔魚發育整個過程中都很低;TRβs的表達水平在變態高峰增加, 于變態高峰后達到峰值, 高水平的TRβs在變態完成的稚魚中尚在持續[3,12,13]。

那么TH是如何調控牙鲆仔魚的變態? 鑒定出TRs直接調控的靶基因是一個關鍵。通過牙鲆轉錄組及基因組TRE數據庫篩選, 結合生物信息學分析,初步確定候選靶基因atoh8(Gene ID:109627718)。atoh8(Atonal homolog 8, atonal bHLH transcription factor 8), 屬于堿性螺旋-環-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)轉錄因子, 參與斑馬魚視網膜細胞和體節肌肉細胞的發育分化, 在視網膜和體節發育的調控過程中,atoh8起著不可或缺的重要作用[14]。關于atoh8與甲狀腺激素調控通路的關系尚未見報道。

本研究克隆了牙鲆TRαA基因及atoh8基因5′-側翼序列各缺失片段, 并成功構建p3×Flag-TRαA和pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(含候選靶基因5′-側翼序列的缺失片段), 通過在HEK293T細胞中共轉染p3×Flag-TRαA和pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708的雙熒光素酶報告實驗, 分別探究不同的5′-側翼序列長度和對同一5′-側翼序列進行不同處理(TRαA和T3都不加、只加TRαA或同時加TRαA與T3)對啟動子轉錄活性的影響, 以期鑒定出TRαA受體是否結合在atoh8基因5′調控區特異的TRE序列來調控該基因的轉錄并判別具體是哪個TRE位點起到了關鍵作用, 最終鑒定出atoh8是否為TRαA介導甲狀腺激素調控的直接靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出膜后20d (20dph,days post hatching)、28d(28dph)的牙鲆仔魚, 采自中國水產科學研究院北戴河中心實驗站; HEK293T細胞購自ATCC細胞庫。DMEM、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA購自Gibco; 細胞裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、ECL化學發光試劑盒購自上海威奧; 一抗Anti-Flag Tag (1E6) Monoclonal Antibody (GNI4110-FG)購自上海睿星, 二抗HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG (D110087)、5×蛋白質加樣緩沖液、平端 DNA 片段添dA試劑盒購自上海生工, 引物合成由上海生工完成; BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀, Anti-DYKDDDDK G1 Affinity Resin和DYKDDDDK Peptide購自金斯瑞; DNaseI、反轉錄試劑盒、FuGENE?HD轉染試劑均購于Promega; 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自YEASEN,EcoRⅠ、KpnⅠ-HF、XhoⅠ限制酶、T4 DNA Ligase購自NEB; X-gal、IPTG購自天根, 2 × Phanta Max Master Mix購自Vazyme, pEASY?-T5 Zero購自全式金,DH5α購自上海唯地; TaKaRa LATaq、pMD19-T、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa, 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提、無內毒素質粒大提試劑盒購自Omega。p3×Flag、pGL3-Basic載體由上海海洋大學李名友教授惠贈。

1.2 方法

總RNA提取和反轉錄將28dph仔魚按照Trizol?Reagent(Invitrogen)試劑盒說明書提取總RNA。檢測總RNA純度、濃度和完整性[15], 均符合要求后置于-80℃保存; 將上述RNA用DNaseⅠ處理后, 按Su等[16]方法反轉錄, 產物cDNA用于PCR擴增或-20℃保存。

牙鲆TRαA基因CDS區的克隆從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中獲取牙鲆TRαA基因序列(Gene ID: 109641414), 根據其序列和p3×Flag多克隆位點設計一對引物TRαA1252-F/R(表 1), 以上述cDNA為模板, 通過2×Phanta Max Master Mix擴增CDS區全長。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳, 膠回收純化目的片段, 加A, 連接至pEASY?-T5 Zero, 轉化DH5α。挑取陽性單克隆, 經菌液PCR驗證有大小正確的片段插入后測序, 交由上海生工完成。

重組真核表達載體p3×Flag-TRαA的構建將上述測序正確的菌液和p3×Flag擴大培養提質粒;用EcoRⅠ、KpnⅠ37℃雙酶切; 將鑒定正確的酶切PCR產物與p3×Flag載體分別進行膠回收, 產物按摩爾比3∶1經T4 DNA Ligase 16℃連接16h; 轉化DH5α, 挑取陽性單克隆, 搖菌提質粒, 雙酶切驗證,再送上海生工測序驗證; 將鑒定正確的p3×Flag-TRαA擴大培養, 提取不含內毒素的重組質粒。

HEK293T細胞培養及瞬時轉染HEK293T細胞培養于10% FBS-DMEM 培養液中, 置于37℃,5% CO2的培養箱中常規培養, 轉染前一天接種于6孔細胞培養板1.5 mL不含抗生素的10% FBSDMEM中, 轉染時細胞密度為90%—95%。配制轉染復合物[3 μg p3×Flag-TRαA(實驗組)或p3×Flag(陰性對照), 7.5 μL FuGENE?HD轉染試劑, 無抗生素、無血清DMEM補至500 μL], 混勻后室溫孵育10—15min, 加到6孔板相應孔中, 未轉染質粒作為空白對照, 每組(未轉、空載、重組質粒)設4個重復, 一組用于總蛋白提取, 其余3組用于總RNA提取。培養6h左右換完全培養基, 48h后進行總蛋白和總RNA提取。

TRαA基因的RT-PCR及實時定量PCR檢測將上文中RNA反轉錄成cDNA, PCR擴增TRαA基因CDS區全長與18S定量內參基因。在CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)上分別制作目的基因TRαA和內參基因18S的標準曲線, 在符合要求后, 隨后定量分析所有樣品。反應體系(20 μL): 1 μL cDNA, 各1 μLTRαA-qF/R或18S-qF/R (表 1), 10 μL TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)和7.0 μL DEPC水; 反應條件:95℃ 3min; 95℃ 10s, 60℃ 30s, 采集熒光40次。該實驗中, 生物學重復n=3, 技術重復2次。

表 1 TRαA基因的擴增和定量引物Tab. 1 The primer used for cloning and real time quantitative PCR of TRαA gene

TRαA的mRNA相對表達量通過2-ΔΔCt[17]方法計算, 其結果以平均值±標準誤差(Mean±SE)來表示(n=3)。通過SigmaPlot 12.0軟件作圖分析,利用SPSS 22軟件中的One-Way ANOVA方差分析法分析不同樣品間的相對表達差異, *P＜0.05時表示差異顯著。

Western blot檢測融合蛋白的表達按上文方法轉染HEK293T細胞, 經PBS洗2次, 1000 r/min離心5min分類收集HEK293T細胞; 加入預冷含PMSF (裂解液∶PMSF=99∶1)的細胞裂解液, 現配現用, 混勻后冰上輕微搖晃10min; 4℃、13000 r/min離心5min, 取上清, 分裝使用或-80℃凍存。參考說明書用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。

分別吸取上述蛋白樣品10 μg, 裂解液補至20 μL,加入5×SDS-PAGE加樣緩沖液5 μL 100℃干式恒溫10min, -20℃保存或加樣進行SDS-PAGE電泳, 將分離的蛋白條帶電轉印至 PVDF 膜上, TBST洗2次(每次10min, 下述一樣); 再將 PVDF 膜浸于含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1h, TBST洗2次; 按1∶1000用TBS稀釋一抗(小鼠抗Flag標簽單抗)4℃孵育過夜, TBST洗3次; 按1∶5000用TBST稀釋二抗(HRP標記的山羊抗小鼠 IgG)37℃孵育1h, TBST洗3次; 將PVDF膜與ECL發光液避光充分接觸1min, 在暗室X光片下曝光拍照。

融合蛋白3×Flag-TRαA的純化采用T25瓶整瓶細胞轉染, 且質粒與轉染試劑比為4 μg∶8 μL,按上述方法收集細胞提取總蛋白。目的蛋白TRαA的N端融合有3×Flag標簽, 通過G1親和層析柱純化后, 分別保留總蛋白原液、流出液、洗雜液和洗脫液, 洗脫液經無菌濾器過濾除菌后, -80℃保存,Western blot檢測純化效果。

TRαA直接調控候選靶基因的篩選與重組報告基因表達載體pGL3-Pro-atoh8的構建 通過轉錄組數據(正常樣品, 甲狀腺素處理樣品)篩查, 及基于現有上傳的牙鲆基因組建立的TRE數據庫篩選, 結合TREs識別類型, 從NCBI中獲取牙鲆候選靶啟動子5′-側翼序列, 利用在線網站http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/, https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/, http://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/等預測靶啟動子轉錄活性及轉錄因子結合位點。初步確定候選靶啟動子, 如atoh8(Gene ID:109627718)。

采用苯酚抽提法從20dph仔魚中提取基因組DNA。根據atoh8基因5′-側翼序列和pGL3-Basic多克隆位點設計3對引物(表 2), 固定下游引物, 改變上游引物以缺失預測出的TRE位點, 以基因組DNA為模板, 經TaKaRa LATaq擴增先得到atoh8啟動子最長的缺失片段。

按上述方法(產物連至pMD19-T, 用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切, 酶切PCR產物和pGL3載體4℃連接過夜)獲得pGL3-Pro-atoh8-1517。再以pGL3-Proatoh8-1517為模板, 按如上方法獲得pGL3-Proatoh8-1333/708。

表 2 候選靶啟動子各缺失片段的擴增引物Tab. 2 The primer used for cloning each missing fragment of the candidate target promoter

雙熒光素酶報告實驗參考前文方法將HEK293T細胞接種于96孔細胞培養板, 配制轉染復合物[10 ng內參質粒 phRL-TK, 100 ng空載pGL3-Basic或100 ng重組質粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(或含100 ng重組質粒p3×Flag-TRαA),0.22 μL FuGENE?HD 轉染試劑, 無抗生素、無血清DMEM補至10 μL], 混勻后室溫孵育10—15min,加到96孔細胞培養板相應孔中, 繼續培養, 6h后換完全培養基, 再 24h后向轉染的細胞中加入0.1 μL T3(終濃度為150 ng/μL), 再24h后檢測并計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值, 每個轉染組設置3個復孔, 重復3次。數據采用SigmaPlot 12.0作圖, 并通過SPSS 22軟件中的單因素方差分析“一般線性模型”-“單變量”和LSD進行相對表達分析, 當*P＜0.05時接受差異顯著。

2 結果

2.1 牙鲆TRαA基因CDS區的克隆和p3×Flag-TRαA的構建

以28dph牙鲆仔魚 cDNA 為模板進行PCR擴增,電泳結果顯示片段大小約為1.2 kb, 與NCBI上傳(XM_020105869.1)的大小相一致; 實際擴增得到片段大小是1252 bp, 并成功構建了p3×Flag-TRαA重組質粒。測序結果顯示CDS區第850個核苷酸穩定由A突變為G, 導致氨基酸由Ser轉變為Gly; 920—1030 bp有兩小段, 分別是連續9 bp、連續11 bp與NCBI上傳序列始終不同, 且不同的高保真酶擴增測序結果相同。

2.2 牙鲆TRαA基因推導氨基酸序列分析及蛋白結構預測

利用ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)平臺, 分析TRαA基因編碼序列所推導蛋白質的基本理化性質, 預測蛋白質的相對分子量為47 kD, 理論等電點是7.06。Leu、Lys、Glu、Ser含量比較高, 分別為 8.4%、8.2%、7.9%、7.5%。利用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)在線軟件, 分析TRαA的三級結構(圖 1), 結果顯示該蛋白含有8個不同長度的α 螺旋結構、1個典型的β轉角和無規卷曲。

圖 1 牙鲆TRαA受體蛋白結構預測Fig. 1 Prediction of protein structure of P. olivaceus TRαA receptor

2.3 TRαA基因的RT-PCR及實時定量PCR檢測

RT-PCR產物電泳結果顯示, 實驗組在長度1200 bp處顯示有一特異性條帶, 與預期大小相同,而對照組均出現一個相應的亮度減弱且二者亮度相同的條帶, 原因可能是HEK293T細胞中存在牙鲆TRαA基因的同源序列; 實時定量PCR也顯示, 與對照組相比, 實驗組TRαAmRNA表達水平顯著升高,這都表明轉染p3×Flag-TRαA的HEK293T細胞中, 成功轉錄出牙鲆TRαAmRNA(圖 2)。

圖 2 重組質粒或空載轉染HEK293T細胞TRαA mRNA RTPCR及實時定量RT-PCR表達分析Fig. 2 RT-PCR and real time quantitative RT-PCR analysis of P.olivaceus TRαA mRNA in the HEK293T transfected with recombinant or vacant vector using 18S as an internal reference

2.4 融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot檢測

BCA法(圖 3)測得未轉染、空載轉染和重組質粒轉染HEK293T細胞提取的總蛋白濃度分別是2.055、1.650和3.440 μg/μL, SDS-PAGE上樣10 μg分離蛋白條帶后, Western blot分析顯示重組質粒轉染組檢測到一條50 kD大小條帶, 其蛋白分子量與3×Flag-TRαA融合蛋白的大小相符; 而未轉染及空載轉染組未檢測到目的條帶(圖 4)。原則上空載轉染組可被抗Flag標簽單抗特異性識別, 只因3×Flag蛋白分子與目標融合蛋白相比太小僅2.9 kD,分離膠底部被切除或已跑脫導致無法檢測到。

2.5 目的蛋白的分離純化

通過Western blot在洗脫液中可檢測出50 kD左右的蛋白, 即通過親和層析、過濾除菌得到了純化的融合蛋白3×Flag-TrαA(圖 5)。

2.6 候選靶啟動子的篩選與重組報告載體構建

根據atoh8基因啟動子轉錄因子結合位點預測結果, 分別設計了3個上游引物, 1個下游引物, 試以牙鲆基因組DNA 為模板擴增atoh8基因5′-側翼序列的各缺失片段, 電泳結果顯示其大小約為1500、1300和700 bp, 實際擴增出的片段大小為1517、1333和708 bp (圖 6A為其實際擴增測序的序列, 引物與預測TREs位點已標出), 與NCBI上傳的大小稍有出入, 并成功構建了重組質粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708。

圖 3 BCA法測定蛋白濃度標準曲線Fig. 3 Determination of protein concentration standard curve by BCA method

圖 4 融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot分析Fig. 4 Western blot analysis of fusion protein 3×Flag-TrαA

圖 5 純化融合蛋白3×Flag-TRαA的Western blot分析Fig. 5 Western blot analysis of purified fusion protein 3×Flag-TRαA

2.7 atoh8基因啟動子研究

根據預測TRE位點所在位置, 分別截取了3個缺失片段, 大小分別為1517、1333和708 bp, 依次包含3個、2個、1個TRE位點, 測序結果如圖 6A所示,各缺失片段起止區段如圖 6B所示。分別檢測每一缺失片段的啟動子轉錄活性, 對每一缺失片段進行3種處理(不加TRαA和T3、只加TRαA或同時加TRαA與T3)后再分別檢測其對啟動子轉錄活性的影響, 結果如下: 圖 7A顯示, 與pGL3-Basic轉染組(陰性對照)相比, pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708轉染組報告基因均表達, 表明Pro-atoh8-1517/1333/708都具有啟動子轉錄活性, 且Pro-atoh8-1333活性最高, Pro-atoh8-1517活性最低; 圖 7D顯示, 與僅轉染pGL3-Pro-atoh8-708相比, 同時轉染pGL3-Proatoh8-708和p3×Flag-TRαA的報告基因的表達量無顯著變化, 再加T3后也無顯著變化, 說明此缺失片段不存在TRαA受體介導T3調控的TRE位點; 圖 7C則表明, 與只轉染pGL3-Pro-atoh8-1313相比, 同時轉染pGL3-Pro-atoh8-1313和p3×Flag-TRαA的報告基因的表達量顯著降低, 且這種降低在加T3后其又顯著上調, 說明在Pro-atoh8-1333中存在1個TRE位點; 圖 7B顯示, 與只轉染pGL3-Pro-atoh8-1517相比,同時轉染pGL3-Pro-atoh8-1517和p3×Flag-TRαA的報告基因的表達量略有升高, 再加T3后其顯著升高, 表明Pro-atoh8-1517存在2個TRE位點(包括Proatoh8-1313的1個TRE位點); 顯然, 無論是Pro-atoh8-1517還是Pro-atoh8-1333, T3加入后都會誘導報告基因的轉錄水平顯著升高, 即啟動子轉錄活性顯著增強, 因此說明, T3通過結合在atoh8基因啟動子區(-1497— -688)特異的2個TRE序列上的TRαA受體來調控該基因的轉錄。

3 討論

為了鑒定出TH-TRαA信號通路上直接調控的靶基因, 綜合預測出候選靶基因atoh8(Gene ID:109627718), 克隆其5′-側翼序列各缺失片段并成功構建pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708(分別含TRE位點: 3、2、1)。本研究克隆了牙鲆TRαA基因完整CDS區, 全長1251 bp (5′端多加1 bp保證TRαA受體正確翻譯), 且TRαA受體DNA結合結構域(DBD)非常保守, 為調控下游靶基因的轉錄激活與抑制所必需。已有研究[7,18]證實, DBD功能域最保守, 內有2個鋅指結構, 第一鋅指內含有P盒, 為識別并結合TREs之AGGTCA(TRs半位)所必需; 第二鋅指內含有D盒, 識別DR4元件(兩半位之間間隔4個核苷酸)兩半位(half-site)的間隔并參與受體二聚體的形成。RT-PCR、實時定量PCR和Western blot分析均表明成功構建p3×Flag-TRαA重組真核表達載體, 在目的蛋白N端融合Flag純化標簽, 由于3×Flag標簽分子量相對較小, 因此幾乎不會影響蛋白質的活性,純化產物可直接用于蛋白功能的研究。3×Flag-TRαA的外源性真核表達特異性強, 具有翻譯后加工修飾功能, 使其結構、糖基化方式更接近天然蛋白且生物活性穩定[19]。

圖 6 報告基因質粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708示意圖Fig. 6 Schematic diagram of the reporter gene plasmid pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708

進而為了驗證TRαA受體與atoh8基因5′-側翼序列是否存在相互作用, 針對上述截取的atoh8基因5′-側翼序列的3個缺失片段(大小分別為1517、1333和708 bp, 依次包含3個、2個、1個TRE位點),及相應成功構建的重組質粒pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 采用雙熒光素酶報告實驗, 首先檢測了atoh8基因3個不同長度(1517、1333和708 bp)的5′-側翼序列對其啟動子轉錄活性的影響, 其次針對每一缺失片段, 進行了3種處理: 不作任何處理(TRαA和T3都不加)、只加TRαA或同時加TRαA與T3, 分別檢測其對啟動子轉錄活性的影響。需要指出的是, 截取的atoh8基因5′-側翼序列長度為708 bp時, 相關轉染組結果顯示TRαA受體和T3對其啟動子活性并無顯著作用, 故不進行分析討論, 以下僅討論關于pGL3-Pro-atoh8-1517/1333轉染組的情況。研究表明, 與對照組相比, 上述2個缺失片段都具有啟動子轉錄活性, 其中截取atoh8基因5′-側翼序列長度為1333 bp時的活性最高, 是長度為1517 bp時的大約3倍。據報道, 并非是截取基因的5′-側翼序列越長其啟動子轉錄活性越高[20], 本文結果亦如此。與僅轉染pGL3-Pro-atoh8-1313的實驗組相比,同時轉染pGL3-Pro-atoh8-1313和p3×Flag-TRαA的報告基因的表達量顯著降低, 但這種降低可被T3顯著上調, 表明此缺失片段存在TRαA介導T3調控的TRE位點。對于pGL3-Pro-atoh8-1517轉染組, 雖然pGL3-Pro-atoh8-1517包含pGL3-Pro-atoh8-1333的TRE位點, 但在TRαA受體加入后, 與不作任何處理組相比, 其啟動子轉錄活性反而略有升高, T3加入后又使得其啟動子轉錄活性顯著升高, 這提示在加入與pGL3-Pro-atoh8-1333轉染組等量的TRαA受體后, pGL3-Pro-atoh8-1517 5′端第1個TRE位點與第2個TRE位點結合TRαA受體, 綜合效應是第1個TRE位點中和了第2個TRE位點TRαA受體對靶基因轉錄水平的降低, 說明第1個TRE位點起了一個正向調節作用。也就是說, pGL3-Pro-atoh8-1517包含的5′端起第1個TRE位點與第2個TRE位點通過TRαA受體介導T3調控著atoh8基因的表達水平, 避免表達過強或不足, 這可能是機體實現精準調控atoh8基因表達的一種方式。但無論是pGL3-Proatoh8-1517轉染組還是pGL3-Pro-atoh8-1333轉染組, T3對atoh8的轉錄水平都是一種正向調節作用。

圖 7 牙鲆atoh8基因啟動子活性測定Fig. 7 Determination of promoter activity of P. olivaceus atoh8 gene

綜上所述, 本研究結果表明pGL3-Pro-atoh8-1517包含2個TRE位點, 且TRαA受體通過DNA結合結構域(DBD)結合在atoh8基因5′調控區-1497—-688特異的TRE序列來調節該基因的轉錄, 由此證明atoh8是TRαA介導TH調控的直接靶基因。本研究為深入探究甲狀腺激素受體TRαA介導甲狀腺激素調控的信號通路提供了基礎依據。