小檗堿對高糖誘導心肌細胞AMPK-AS160-GLUT4通路的調節及保護作用

王瑞瑤，霍夢露，李超，關錫梅，倪偉建，唐麗琴

[1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230031；2.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)藥劑科]

糖尿病是一類以胰島素分泌的絕對或相對不足而引起的持續性高糖為特征，并伴有脂肪，蛋白質代謝紊亂的內分泌性疾病[1]。糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的、與血管疾病同時伴行或單獨發生的特殊性心肌病，是糖尿病最為嚴重的并發癥之一[2]。糖尿病心肌病狀態下由于心臟代謝紊亂，微血管病變引發心臟廣泛灶性壞死，出現亞臨床心功能異常，最終發展為心律失常、心力衰竭以及心源性休克[3]。目前糖尿病心肌病發病原因尚不清楚，研究顯示，慢性高血糖會通過電子鏈使活性氧(ROS)大量生成，進而誘發心肌細胞凋亡。2型糖尿病患者通常伴隨高胰島素血癥，在高胰島素和胰島素抵抗情況下心臟對于葡萄糖利用明顯減弱，從而使心臟更多依賴于脂肪酸氧化進行能量代謝，相應的葡萄糖轉運蛋白GLUT1及GLUT4表達減少，導致心臟能量代謝效率大幅降低[4]，其中GLUT4主要在胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細胞中表達，因此刺激GLUT4質膜轉運將會是改善心臟葡萄糖代謝障礙重要的一環[5-8]。小檗堿(BBR)是黃連根莖中的主要成分，有降血糖、降血脂之功效，為黃連治療消渴的物質基礎。有研究報道，小檗堿可通過激活AMPK抑制脂肪合成，改善胰島素抵抗[9]。AMPK為生物能量代謝關鍵分子，其所調控的AS160蛋白即為GLUT4關鍵激動蛋白。因此本實驗將通過高糖誘導心肌細胞模擬糖尿病機體心臟高血糖環境，探討BBR對高糖誘導心肌細胞糖代謝功能以及心肌細胞損傷是否有改善作用，為BBR治療DCM提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 H9c2(2-1)大鼠心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫，使用Low Glucose DMEM培養基+10%胎牛血清+1%雙抗培養，培養環境溫度37 ℃，5%CO2濃度。

1.2 藥品與試劑 小檗堿由中國科學技術大學附屬第一醫院藥劑科提取純化(小檗堿純度98%)；兔抗腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)單克隆抗體，兔抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)單克隆抗體，兔抗丙酮酸脫氫酶(PDH)單克隆抗體，兔抗磷酸化糖代謝調節蛋白(P-AS160)，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自CST公司;兔抗葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)，兔抗糖代謝調節蛋白(AS160)，購自Abcam公司；辣根酶標記的山羊抗兔IgG購自CST。Immobilon Western ECL化學發光試劑盒，PVDF膜購自Millpore；磷酸酶抑制劑，蛋白酶抑制劑購自Med Chem Express；Quickblock一抗稀釋液，Quickblock二抗稀釋液，SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒，PMSF，RIPA裂解液(強)，BCA蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，曲拉通X-100，DAPI染色液，青霉素-鏈霉素雙抗，胰酶細胞消化液購自碧云天；甘氨酸，Tris購自北京索萊寶；H9C2(2-1)大鼠心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM低糖培養基購自Hyclone；胎牛血清購自Gibco；CCK-8試劑盒，膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自上海貝博；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自南京維諾贊公司；鬼筆環肽購自Sigma；4%多聚甲醛購自Biosharp。

1.3 主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化技術有限公司；細胞培養箱，上海力申科學儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌器，上海申安儀器廠；金屬浴，杭州博日有限公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；電子分析天平，Mettler Toledo公司；純水機，力康儀器有限公司；超低溫冰箱，中科美菱有限公司；高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；酶標儀，美國Molecular Devices公司；搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電泳裝置及轉膜裝置，上海天能科技有限公司；制冷劑，常熟市雪科電器有限公司；化學發光成像儀，上海培清科技有限公司。流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。熒光顯微鏡，德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞計數 臺盼藍染色液經0.22 μm濾膜過濾備用。將細胞消化，細胞懸液轉移至EP管中吹打混勻，取10 μL細胞懸液與臺盼藍染液等體積混勻，吸取10 μL至細胞計數板。將計數板插入細胞自動計數儀，于顯示屏上可見活細胞呈中間通透圓點狀，死細胞為實心深色圓點狀，待機器自動計算板中活細胞及死細胞數量，記錄數據。

1.4.2 細胞活力檢測 根據細胞計數結果，將細胞加入培養基稀釋密度至1×105/mL。橫向加入96孔板各孔100 μL細胞懸液，邊緣36孔加入PBS。待細胞長至70%～80%，棄去原培養基，分別加入高糖(葡萄糖濃度50 mmol/L)及BBR(濃度分別為25、50、100 μmol/L)組，模型組(葡萄糖濃度50 mmol/L)和健康對照組干預24 h。各孔加入培養基體積十分之一體積即10 μL CCK-8試劑。4 h內任意時間點讀板，選取吸光度(OD)值在1.0附近時分析。

1.4.3 細胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡，分組為健康對照組，高糖誘導模型組及高糖條件下BBR(濃度分別為25、50、100 μmol/L)加藥組，心肌細胞培養24 h后收集各實驗組細胞，控制1×106個細胞與500 μL工作液中，加入10 μL FITC染液，混勻避光室溫孵育10 min，再在每組加入5 μL PI染液同樣混勻避光室溫孵育10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

1.4.4 心肌細胞骨架觀察 將心肌細胞接種在24孔板中，分組同1.4.3分別加入高糖及小檗堿刺激24 h，棄去培養基，用37 ℃水浴中預熱的PBS洗2次，向各孔中加入150 μL 4%多聚甲醛固定細胞，室溫孵育10 min。吸出多聚甲醛，用PBS沖洗2次，加入200 μL 0.1%曲拉通，室溫孵育5 min后用PBS沖洗2次。向每孔中剛加入100 μL現配0.1%鬼筆環肽，室溫避光孵育30 min，于搖床上使用PBS洗3次，每次5 min，再加入100 μL DAPI染液，室溫避光孵育10 min，用PBS清洗2次，每孔加入200 μL PBS于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5 Western blot檢測相關蛋白表達 取處于對數生長期細胞，分組為高糖條件下BBR(25、50、100 μmol/L)濃度組，模型組，對照組，以1×108個/孔接種六孔板，加藥處理24 h后使用細胞刮收集細胞，加入RIPA裂解液及膜蛋白或胞漿蛋白提取試劑盒分別提取細胞總蛋白或膜蛋白，BCA定量測定蛋白濃度。總蛋白與膜蛋白分別加入1/4體積的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，總蛋白放入沸水煮沸5 min后備用，膜蛋白-80 ℃保存備用。待SDS-PAGE凝膠電泳結束，切膠轉PVDF膜，放入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TPBS洗滌3次，置于配置好的辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，利用Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內參考察各蛋白變化。

2 結果

2.1 BBR對高糖誘導心肌細胞存活率影響 圖1的CCK-8結果顯示，高糖刺激24 h后，與健康對照組相比，高糖組細胞存活率明顯下降；BBR(25、50、100 μmol/L)與高糖組相比可以逐步提高心肌細胞存活率，且呈濃度相關性。

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05

圖1BBR對高糖誘導心肌細胞存活率的影響(n=3)

2.2 BBR對高糖誘導心肌細胞凋亡的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡率。圖2流式細胞儀檢測結果顯示，模型組與對照組相比，高糖能明顯誘導心肌細胞凋亡；高糖條件下BBR(25、50、100 μmol/L)加藥組與模型組比較，加藥組可以明顯降低心肌細胞凋亡率，對心肌細胞起到一定的保護作用。

2.3 BBR對高糖誘導心肌細胞形態影響 鬼筆環肽染色結果顯示，高糖誘導心肌細胞與正常組細胞相比，細胞呈肥大表現，BBR干預組(25、50、100 μmol/L)則可不同程度上改善心肌細胞肥大，使細胞形態趨于正常。見圖3。

2.4 BBR對高糖誘導心肌細胞AMPK、P-AMPK、AS160、P-AS160、PDH、GLUT4蛋白表達影響 AMPK蛋白是生物能量代謝關鍵分子，其調控AS160從而激活GLUT4向膜外轉運，維持細胞正常葡萄糖攝取功能。PDH為丙戊酸脫氫酶，是催化丙酮酸不可逆的氧化脫羧為乙酰輔酶A的限速酶。

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05

圖2BBR對高糖誘導心肌細胞凋亡的影響(n=3): A-E:Annexin V-FITC/PI雙重染色法檢測BBR對心肌細胞凋亡的影響；F：不同組大鼠心肌細胞凋亡率比例的定量分析

Western blot結果顯示，與正常組比較，高糖組P-AMPK、P-AS160、PDH、胞膜GLUT4含量明顯降低；與高糖組相比，BBR(25、50、100 μmol/L)可以不同程度提高心肌細胞內P-AMPK、P-AS160、PDH、胞膜GLUT4的表達水平。見圖4。

3 討論

DCM作為糖尿病最為嚴重并發癥之一，病理特征表現為心肌細胞肥大、間質纖維化和PAS陽性的物質浸潤，冠狀小動脈基底膜增厚，心肌內可見微血管病變[10]。糖尿病心血管病變中，DCM發病率最高，目前已成為老年糖尿病患者死亡的主要原因。由于發病機制尚不清楚，目前DCM的治療主要是通過控制血糖及血壓實現的，并沒有較為理想的藥物。因此進一步探索DCM發病機制，以便制定更加有效合理的治療方案顯得尤為重要。

有研究顯示，慢性高血糖可引起心肌細胞損傷，高脂血癥會使脂肪酸大量進入心肌細胞，進而致使細胞脂肪酸氧化過載產生脂毒性[11]。因此心肌細胞的能量代謝障礙或許是DCM發病的重要原因。正常心肌細胞中，脂肪酸氧化與葡萄糖、乳酸代謝共同供能于心臟，保證其正常收縮功能[12-13]。而在高血糖環境中，葡萄糖轉運蛋白活性下降，影響細胞對葡萄糖跨膜運輸速率，導致葡萄糖代謝提供ATP不足，進而導致心臟供能不足。本實驗則從改善心肌細胞葡萄糖代謝入手，觀察小檗堿是否可以通過AMPK-AS160通路刺激GLUT4的向膜轉運，從而逆轉糖尿病狀態下的心臟糖代謝障礙。

本實驗中，通過考察心肌細胞活力值，凋亡率，細胞形態觀察以及相關通路蛋白的表達分析小檗堿對HG誘導心肌細胞的保護作用。從實驗結果可得知小檗堿可一定程度提高HG條件下心肌細胞活力值，降低心肌細胞凋亡率，改善心肌細胞肥大[14]。通路蛋白中，小檗堿激活AMPK的磷酸化，從而刺激下游通路AS160，促進GLUT4的質膜轉運過程。

圖3 BBR對高糖誘導H9c2(2-1)大鼠心肌細胞形態影響(×200)

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.01，cP<0.05

圖4BBR對AMPK、AS160、PDH和GLUT4蛋白表達的影響(n=3)

這提示到小檗堿可通過激活AMPK通路改善HG誘導心肌細胞葡萄糖代謝障礙情況。但其通過何種方式進入細胞影響AMPK還有待進一步考證。

綜上所述，本實驗闡明了小檗堿可保護心肌細胞，降低HG誘導下細胞凋亡率，并激活AMPK磷酸化，促進GLUT4質膜轉運，從而起到治療DCM狀態下心肌細胞能量代謝障礙的作用，為治療DCM提供新思路。